云南省烟草镰刀菌根腐病菌遗传多样性分析

【背景和目的】尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的根腐病是烟草主要的土传病害,在云南烟区普遍发生。为分析云南省不同地理来源尖孢镰刀菌的遗传差异性和亲缘关系。【方法】采用ISSR(inter-simple sequence repeat)和SRAP(sequencerelated amplified polymorphism)分子标记技术分析40株菌株遗传多样性。【结果】（1）采用ISSR技术,供试的7条引物共扩增出53条条带,其中多态性条带44条,平均多态性条带83.02%。菌株间的遗传相似系数为0.49～0.96,存在遗传背景差异。遗传相似系数为0.68时,40株菌株可分为3个类群。（2）采用SRAP技术,供试的7对引物共扩增出44条条带,其中多态性条带32条,平均多态性条带72.73%,菌株间的遗传相似系数为0.55～0.96。遗传相似系数为0.70时,40株菌株可分为3个类群,结果与ISSR一致。【结论】云南省烟草尖孢镰刀菌菌株间遗传差异大,ISSR和SRAP分子标记技术可用于烟草尖孢镰刀菌的遗传多样性分析。     

河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析

为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株,根据菌株形态和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性。结果表明,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔。序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和Fusarium nematophilum。致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生。      

云南省烟草镰刀菌根腐病病原鉴定

【背景和目的】烟草镰刀菌根腐病（Fusarium root rot）影响烟叶产量和品质,为明确云南省烟草镰刀菌根腐病病原种类。【方法】采用组织分离法分离病原并进行单孢纯化;结合形态学和分子生物学rDNA-ITS与EF-1α序列鉴定病原;采用灌根接种法测定病原菌的致病性。【结果】获得的300个菌株在PDA平板上均呈絮状,菌丝白色、紫色或粉红色,大型分生孢子无色、多孢、多为镰刀形;小型分生孢子无色、多无隔,呈椭圆形或纺锤形。经序列比对将300菌株鉴定为7个种,其中227株为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,占比75.7%;43株为茄病镰刀菌（F. solani）;16株为共享镰刀菌（F. commune）;8株为木贼镰刀菌（F. equiseti）;3株为层出镰刀菌（F. proliferatum）;2株芬芳镰刀菌（F. redolens）和1株轮枝镰刀菌（F. verticillioides）。【结论】云南省烟草镰刀菌根腐病病原为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、共享镰刀菌、木贼镰刀菌、层出镰刀菌、芬芳镰刀菌和轮枝镰刀菌,其中尖孢镰刀菌为优势菌。     

双孢蘑菇SCAR标记的建立及在菌株群鉴定中的应用

根据15条具有菌株群特异性的SRAP、ISSR、RAPD扩增产物DNA条带测序结果,设计64对SCAR引物,其中6对引物能成功扩增出目的条带,即有6条特异片段(A、C、E、G、H、J)被成功转化为SCAR标记.通过这6个SCAR标记的不同组合,将40个双孢蘑菇菌株分为9个类群和6个类群,与基于SRAP、ISSR、RAPD资料的聚类分析结果的组间距离值取13和16时的分类结果完全吻合.对A片段的SCAR-PCR检测结果是:可从40个双孢蘑菇菌株中鉴别出双孢蘑菇333号菌株(编号01).     

致病性尖孢镰刀拮抗菌的筛选与鉴定

该研究从清香型白酒大曲中筛选出一株对致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）拮抗效果最好的拮抗菌株,采用形态观 察、生理生化试验和16S rRNA序列分析对其进行鉴定,并绘制该菌株生长曲线、考察其培养液中的蛋白类及脂肽类物质的抑菌效 果。 结果表明,从清香型白酒大曲中筛选出一株对致病性尖孢镰刀菌拮抗效果最好的拮抗菌株,编号为P9,其抑菌圈直径达到20 mm 左右。 经鉴定,拮抗菌P9为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;生长曲线结果表明,拮抗菌P9在第9小时生长速率达到最大;抑菌物 质提取实验表明,拮抗菌P9能分泌具有抑菌作用的蛋白类物质及脂肽类物质。     

双孢蘑菇SRAP、ISSR、RAPD标记遗传多样性和菌群分类研究

通过PCR试验,筛选能扩增清晰稳定的DNA条带的53对SRAP引物、10条ISSR引物和56条RAPD引物。SRAP、ISSR和RAPD 3种DNA分子标记扩增位点的平均多态率分别为70.21%、78.33%、61.94%。SRAP、ISSR和RAPD扩增结果用0与1表示,共获得1 046个位点的42 840个数据。采用组间距离法和Jaccard相似性系数,应用SPSS 11.0 for Windows软件进行聚类分析,构建40个双孢蘑菇样品的遗传关系树状图。当组间距离值取16时,40个双孢蘑菇品种可分为6个类群;当组间距离值取13时,40个双孢蘑菇品种被分为9个类群。     

甘肃窖藏马铃薯干腐病病原菌分离鉴定及致病性分析

目的 明确引起甘肃马铃薯主产区窖藏块茎干腐病致病菌的种类,确定强致病性的优势种群。方法 通过组织分离法从甘肃省通风贮藏库窖藏的典型马铃薯干腐病发病块茎组织中分离纯化获得病原菌,采用形态学结合真菌ITS序列进行菌种鉴定,用MEGA软件比较亲缘关系,根据柯赫氏法则测定分离菌株对‘大西洋’和‘陇薯7号’马铃薯微型薯的致病性。结果 从采集的马铃薯罹病组织中分离纯化得到15株真菌,分别鉴定为三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、茄病镰刀菌(F. solani)、锐顶镰刀菌(F. acuminatum)、木贼镰刀菌(F. equiseti)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和环孢镰刀菌(F. annulatum),分离频率在6.67%～26.67%之间。6种镰刀菌均可导致马铃薯块茎发病,其中锐顶镰刀菌、三线镰刀菌和茄病镰刀菌引起的病斑显著大于其他3种镰刀菌引起的病斑。结论 引起甘肃窖藏马铃薯干腐病的病原菌主要有三线镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和环孢镰刀菌,致病力强的优势种群为锐顶镰刀菌、三线镰刀菌和茄病镰刀菌。环孢镰刀菌作为马铃薯干腐病的致病菌属首次...     

根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系构建

  背景和目的  尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）可引起烟草镰刀菌根腐病（Fusarium root rot of tobacco）,为明确病原菌致病相关基因。  方法  以烟草强致病性尖孢镰刀菌菌株B-9-1的分生孢子为受体,利用携带潮霉素B（hygromycin B,hyg）质粒的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化,获得能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的尖孢镰刀菌转化菌株,构建烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系。  结果  （1）尖孢镰刀菌的最优转化体系为:潮霉素B最适质量浓度50 μg/mL,在25℃条件下,以1 cm宽的条形硝酸纤维膜为载体,将携带有pCAM-GFP-hyg质粒的根癌农杆菌摇菌培养至OD₆₀₀=0.7,与震荡培养24 h获得的浓度为106个/mL的尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液在含有200 μmol/L乙酰丁香酮的共培养基上共培养48 h。（2）转化子继代培养、PCR检测和荧光显微观察结果表明外源GFP基因成功整合到烟草尖孢镰刀菌基因组中并可以进行稳定遗传表达。（3）Sourthern blot分析结果进一步证明T-DNA成功整合到尖孢镰刀菌基因组中,且60%以上为单拷贝插入。  结论  本研究成功构建了根癌农杆菌介导的烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系,为烟草尖孢镰刀菌基因功能及病原菌的致病机制研究提供基础。      

哈密瓜(Cucumis melo L.)致腐真菌的鉴定

研究从哈密瓜表面分离出引起其腐败的菌株A和菌株B,并采用显微镜形态学观察、表型特征和分子生物学三种方法对其进行鉴定。结果发现菌株A可利用碳源包括杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麦芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等72种碳源,其ITS rDNA序列与尖孢镰刀菌甜瓜转化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)的同源性为99%,分支长度为0.00。菌株B可利用碳源包括L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等54种碳源,其ITS rDNA序列与链格孢菌(Alternaria alternata)的同源性为100%,分支长度为0.00。因此,推断菌株A为尖孢镰刀菌甜瓜转化型,菌株B为链格孢菌。     

三种不同分子标记技术对灵芝单核体多态性的研究

为了探讨灵芝Ganoderma.lucidum原生质体单核体间遗传多态性,为育种材料的筛选提供分子水平依据。运用ISSR、SRAP、RAPD3种分子标记技术对制得的34株灵芝单核体进行了遗传多样性分析和聚类分析。结果显示,三种分子标记技术共扩增出347条条带,多态性条带为308条,多态比率为88.76%,其中ISSR-PCR扩增效果较好,多态性条带和多态比率最高;119-123与其余菌株相异系数最大,或已发生基因突变。根据综合分析结果,在相异系数为0.67时,可以把剩余33株菌株分为两大类群,Ⅱ类含5株菌株,分别为119-180、119-210、119-212、G0119和119-214,剩余的28株菌株为Ⅰ类。研究表明,ISSR、SRAP和RAPD分子标记可用于灵芝单核体多态性研究,这将为育种材料的筛选提供帮助,减少育种工作量和风险。     

胡麻枯萎病生防芽孢杆菌筛选及抑菌效果研究

为筛选拮抗胡麻枯萎病菌的生防微生物,对采自我国不同省份胡麻根围土壤进行了细菌分离和拮抗菌筛选。根据土样中151株病原菌尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum f.sp.lini（FOL）]对峙培养获得21株拮抗芽孢杆菌,其中XJ2-20拮抗效果最好,盆栽实验的胡麻枯萎病防效可达56.3%,经鉴定为枯草芽孢杆菌。菌株XJ2-20对151株镰刀菌株的抑菌率最高可达64.5%,其发酵滤液可抑制尖孢镰刀菌生长及抑制分生孢子萌发。菌株XJ2-20的抑菌活性物质的最佳硫酸铵沉淀浓度为70%,活性物质对热和胰蛋白酶敏感,最适pH为7。其最佳发酵条件为LB液体培养基（初始pH 7.2）、每300mL三角瓶装液量50～100mL,29℃培养5d。     

23 株酿酒酵母ISSR指纹图谱分析及SCAR标记的建立

目的：构建酿酒酵母菌株的简单重复序列间多态性指纹图谱数据库并建立序列特异性扩增区（sequencecharacterized amplified region,SCAR）标记技术,为酿酒酵母菌株的分类、遗传亲缘关系鉴定及菌种专利保护提供可靠的DNA分子标记技术依据。方法：在简单重复序列间多态性（inter-simple sequence repeat,ISSR）指纹数据分析基础上进行聚类分析并对菌种进行分类鉴定,同时将酿酒酵母菌株9号和15号中扩增获得的ISSR特异性DNA带转化为可以直接用于菌株快速鉴定的SCAR分子标记。结果：构建23 株酿酒酵母的ISSR指纹图谱,并在相似系数为0.85水平上将23 个供试菌株分为3大类,其中,1、2、4、7、15、16、17、19、20、21、23聚为第一类;10、11、12、13、14、18号菌株聚为第二类且10号和11号菌为同一菌株;3、5、6、8、9、22号菌聚为第三类且属于同一菌株。此外,利用所获得的2 个特异性条带成功转化为序列特异性扩增区分子标记。结论：在生产上酿酒酵母菌株遗传背景差异不大,常存在同物异名现象,而采用ISSR指纹及其SCAR分子标记技术快速鉴定酿酒酵母菌株在工业生产上具有重要意义。     

一株海洋梅久兰链霉菌的分离鉴定及其抗真菌作用研究

采用梯度稀释分离法从连云港海域海水、海泥、近海土壤、海洋动物以及海洋植物样品中,分离出海洋放线菌22株,采用平板对峙培养法测定不同放线菌菌株的抑菌作用,有9个放线菌菌株有抑菌作用。其中ZW-1菌株的抑制活性最强,该菌株及其发酵液对供试的小麦雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌(Alternaria solani)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等8种植物病原真菌都有较强的抑制作用,可导致病原真菌菌丝细胞壁膨大,原生质体收缩,同时可抑制菠菜早疫病菌(A. solani)分生孢子的萌发和芽管的伸长。通过培养特性、细胞形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析,将海洋放线菌ZW-1菌株鉴定为梅久兰链霉菌(Streptomyces mediolani)。     

双孢蘑菇RAPD标记的遗传多样性分析

随机抽取108个随机引物对40个双孢蘑菇栽培菌株的DNA进行RAPD-PCR扩增实验,发现有71个随机引物能够扩增出清晰的、稳定的、具有多态性的RAPD条带。结果表明,71个随机引物共扩增出567条DNA带,平均每个引物扩增出7.99条DNA带,其中434条DNA带具有多态性,占总数的76.5%。基于RAPD-PCR扩增资料,采用欧氏距离平方系数和组间连接法,应用SPSS 11.0软件进行聚类分析,探讨40个品种间的亲缘关系与类群划分。当取欧氏距离平方系数阈值为20.5时,所有品种分为三大类;当取欧氏距离平方系数阈值取8.5时,40种双孢蘑菇菌株可被分为6个类群,此结果与双孢蘑菇菌株群的同工酶分类研究结果相当吻合。     

ISSR标记技术辅助形态学的红曲菌株分类鉴定

以市售红曲产品中分离的17株红曲菌株和8株标准菌株为主要材料,根据它们的菌落形态和显微形态特征进行分类,25株菌株归为6类。同时,运用内部简单重复序列（ISSR）标记分类法进行聚类分析,在相似性水平为0.9时,25株菌株聚为5类。综合形态学分类鉴定法和ISSR标记分类法结果,25株红曲菌株被聚为3大类,分别是红色红曲菌（Monascus ruber）、紫色红曲菌（Monascus purpureus）和血红红曲菌（Monascus sanguineus）。结果表明,传统形态学分类方法结合ISSR标记分类法能为红曲菌株的分类鉴定提供综合参考信息。也可为了解市售红曲相关发酵产品生产菌株的分类与特征、进一步发掘和保护红曲菌株资源提供参考。     

芥蓝与菘蓝族间原生质体融合及杂种愈伤分析

运用聚乙烯乙二醇（PEG）和二甲基亚砜（DMSO）共同诱导融合的方法,成功获得芥蓝与菘蓝原生质体融合的再生愈伤。利用9对SRAP随机引物对亲本和再生愈伤DNA进行扩增以鉴别再生愈伤的基因组成,结果表明：在再生愈伤的DNA条带中,与供体菘蓝相同的带占93．07％～94．16％,与受体芥蓝相同的条带占70．24％～75．78％,并有少量新增带和缺失带出现,再生愈伤的DNA带型为双亲的叠加,为真正的族间杂种愈伤。类平均法（UPGMA）聚类分析表明,5个杂种愈伤明显聚在一起,其遗传组成十分相似,与菘蓝的遗传关系较近,而与芥蓝的遗传关系稍远。     

欧洲野生甘蓝的核质遗传多样性和群体遗传结构分析

为了解欧洲野生甘蓝遗传背景,以栽培甘蓝、甘蓝型油菜和白菜型油菜作对比,对引进的7个生态地理群体共80份野生甘蓝材料进行了核质遗传多样性和群体遗传结构分析。利用10对特异性SSR引物分析叶绿体基因组多样性,获得8个差异性标记,将参试94份材料划分为3类,即甘蓝（含栽培和野生甘蓝）、甘蓝型油菜和白菜型油菜;包括6种单倍型,其中野生甘蓝2个,甘蓝型油菜3个,白菜型油菜1个。利用6对SRAP引物对核基因组多样性进行分析,获得75个多态性标记;聚类及遗传结构分析表明7个野生甘蓝群体中,F、D、G三个群体聚为独立的亚类,E群体大部分单株归于G亚类。其它3个群体A、B、C则相互混杂在一起。野生甘蓝群体Nei＇s基因多样性指数（H）和Shannon’s指数（I）分别为0.301 3和0.461 1。分子方差分析（AMOVA）表明野生甘蓝以群体内变异为主,占80%;群体间变异仅占20%。结果显示引进的野生甘蓝群体核质遗传多样性丰富。