大豆粉转基因成分能力验证样品的检测分析

目的 提高实验室对转基因大豆定性检测的准确性和检测人员专业技术水平, 增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR (simplex real-time fluorescence PCR)法对样品内源基因扩增的循环阈值的影响来比较2种方法, 分析2种DNA提取试剂盒的提取质量。对标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》扩增反应体系中DNA模板量进行优化后, 对样品进行检测。再依据标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》的要求, 对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 通过内源基因扩增循环阈值的数据确认, 更能准确反映试剂盒提取的DNA是否满足后续外源基因的分析检测要求。2种标准方法对19-N578和19-M913 2个待测样品的检测显示3种外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均为阴性, 19-N578和19-M913待测样品均为非转基因大豆。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估, 体系中DNA模板量的优化, 检测方法的选择和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素。     

运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌

目的运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌,以提高检验准确度。方法采用传统的增菌、选择性培养、生化鉴定方法进行样品检验,实时荧光PCR法作为辅助手段对BPW增菌液及可疑菌落进行扩增,最后用API20E鉴定系统对可疑菌落进行确认。结果 3个样品经增菌、选择性培养、生化鉴定后均无显著符合沙门氏菌菌落特征及生化特征的可疑菌落;缓冲蛋白胨水增菌液实时荧光PCR法扩增结果表明样品S02为可疑样品,其分离得到的菌落S02-4有典型扩增曲线;经API20E鉴定系统确认,样品S02为阳性样品,阳性菌为猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种。结论实时荧光PCR法操作简单,准确度高,可作为传统检验方法的有效补充。     

蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测

为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子（花椰菜花叶病毒35S启动子 （pCaMV35S）、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（tNOS）、玄参花叶病毒的35S启动子（pFMV35S）、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子（pNOS）、玉米泛素基因的启动子（pUbi）、烟草的花蕊特异性 TA29 的基因发育调节启动子（pTA29）、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子（tE9）、章鱼碱合成酶终止子（tOCS）、谷氨酰胺转移酶7终止子（tg7）、花椰菜花叶病毒终止子（tCaMV35S））为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明：建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。     

TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定

本研究依据GB 4789.4-2016标准对沙门氏菌ACAS-PT526能力验证样品进行常规培养法检测,同时使用TaqMan实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对预增菌培养物进行快速检测和鉴定。本研究首先以沙门氏菌特异性基因hut基因为靶基因,设计合成特异性引物和探针,提取各类食源性菌种的核酸DNA进行实时荧光PCR反应,仅沙门氏菌属出现阳性扩增,非沙门氏菌属、阴性对照和空白对照均无扩增信号,验证设计合成的引物探针具有较高的特异性。其次将能力验证样品和加标样品经预增菌、增菌、分离、纯化、生化试验和血清学鉴定,同时将预增菌培养物经实时荧光PCR测定后,18-D319和加标样品有显著的S型扩增曲线,Ct值分别为24.34和26.21,为沙门氏菌阳性,18-M906无显著荧光信号,Ct值>40.00,为沙门氏菌阴性。经API20E试剂条鉴定,18-D319为猪霍乱沙门菌亚利桑那亚种,鉴定百分率为99.90%,T值为0.97,18-M906为大肠埃希氏菌,鉴定百分率为99.80%,T值为0.94。实时荧光PCR检测结果与常规培养法检测结果一致,且更为简单快速,从预增菌到结果判定仅需12 h,结果准确度高,一批次可检测多个样品,可用于大量样品中沙门氏菌的快速筛查和对能力验证样品的检测验证。     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品

本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%～110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。     

如何做好能力验证样品中转基因成分检测

目的 能力验证是利用实验室间比对来确定实验室检测或校准能力的活动, 是提高检验机构内部质量控制最有效的手段之一。方法 通过参加2012 “CNAS T0659大豆粉中转基因成分定性检测”能力验证获得满意结果, 对实验室参加能力验证过程中应注意的问题做简要分析。结果与结论 标准方法的选择, DNA提取效率, 以及实验过程的质量控制等都是影响能力验证结果的重要因素。     

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

多重PCR方法检测食品中转基因成分

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子和NOS终止子的方法 .并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 1 3份样品中有 6份检出3 5S启动子、NOS终止子 ,其余 7份样品的检测结果为阴性 .表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出 3 5S和NOS成分 ,其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,多重荧光PCR法则更为简便、快速、准确     

常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的 建立4种转基因(genetically modified, GM)大米成分多重定量检测方法, 解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品的高通量精准定量难题。方法 采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析, 并将其转化为含量百分比。结果 转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好, 标准曲线r2值均在0.99以上, 定量相对灵敏度可达0.1%, 相对误差和相对标准偏差值均小于25%, 定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论 本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法, 解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点, 为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。     

实时荧光PCR方法检测转基因豆粕的研究

以美国、阿根廷和转基因大豆标准品为材料,利用设计的特异性引物和探针,建立了实时荧光定量PCR技术检测抗草甘膦转基因豆粕的方法,成功检测出美国和阿根廷抗草甘膦转基因豆粕的内源参照基因lectin、CaMV35S/CTP of EPSPS边界序列和NOS终止子,确定了实时荧光PCR方法检测抗草甘膦转基因豆粕的灵敏度为0.1%。     

利用PCR方法检测水稻及其加工产品中转基因水稻

市场上的转基因产品以及深加工产品越来越多,其安全性引起全世界的极大争论,很多国家的检验机构相继开展了转基因产品的检测工作。以转基因水稻为材料,以聚合酶链式反应(PCR)方法为基础,选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术,针对转入苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简写为Bt)基因水稻的Cry1Ac片段进行PCR检测,建立适合转基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。     

多重聚合酶链式反应技术在食源性致病菌检测上的应用研究进展

多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是在常规PCR技术基础上发展起来的,其反应原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同,区别在于多重PCR技术在同一个反应体系中加入2对或2对以上引物,分别扩增不同的模板,得到不同的目的片段.多重PCR技术在食源性致病菌检测中具有高通量、节...     

食品检测能力验证中沙门氏菌的分离鉴定

目的 参加编号为CFAPA-375的食品中沙门氏菌的检测能力验证,验证实验室沙门氏菌的检测能力.方法 采用国家标准法检测沙门氏菌能力验证样品,同时采用实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法作为辅助方法.对分离出的可疑菌落,采用全自动微生物鉴定系...     

单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品的 制备与验证

目的研究制备适用于验证、评价实验室或检测机构检测能力的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的能力验证冷冻干燥样品。方法对目标菌与干扰菌进行10倍梯度稀释,对不同稀释度的菌液进行菌落计数得到菌含量,确定单核细胞增生李斯特氏菌与干扰菌的添加量;对保护剂和预冻条件进行筛选优化,制备单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品。冻干样品采用西林瓶真空包装,4℃条件下冷藏保存,随机取样检测评估样品均匀性,并在210 d期间内定期抽样检测不同贮存温度下的冻干样品,检测评估样品的稳定性。结果每个冷冻干燥阳性样品最终添加目标菌单增李斯特菌和干扰菌分别为10~2 CFU/m L和10~4 CFU/m L;每个阴性样品添加干扰菌10~4 CFU/m L;最佳冻干保护剂的组合为海藻糖3%,脱脂奶粉8%,谷氨酸钠1.5%。检测结果显示PT冻干样品具有较好的均匀性和稳定性。结论建立的单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品制备方法与评估程序均为有效,适用于验证与评价实验室或检查机构检测能力,满足能力验证活动的要求。     

Detection of peanut using real-time polymerase chain reaction

Preliminary results are presented on a sensitive and robust assay for the identification of peanut in commercial products using real-time PCR technology. Peanut specific primers and probe, designed using the Arah 2 gene, were optimised for real-time PCR using an ABI PRISM 7700. Commercial extraction kits employing different technological strategies were assessed for the extraction of PCR quality peanut DNA template. The specificity of the primer and probe set was determined using a wide range of food items and the limit of detection and quantification calculated using dilutions of peanut DNA. The assay was used to detect spiked or trace level of peanut in commercial samples and was finally used to detect peanut in a biscuit prepared with 2 ppm of lightly roasted peanut powder.An erratum to this article can be found at     

菠萝成分的实时荧光PCR检测方法的建立

目的本文研究建立食品中菠萝成分的实时荧光PCR检测方法。方法根据菠萝rbcL基因设计菠萝物种特异性检测引物和荧光探针,对样品中的靶标基因片段进行检测,并进行物种特异性检测、灵敏度测试和实际应用检测。结果通过对供试的58种动植物材料进行检测,只有菠萝出现特异性扩增,其他物种材料无扩增;对不同浓度菠萝DNA样品和不同含量的菠萝粉样品进行灵敏度测试,该检测方法对菠萝成分的检测灵敏度分别为0.01 ng/μL菠萝DNA和0.1%菠萝粉;对市场销售的实际样品进行检测,能够满足于检测需求。结论该方法简单、灵敏、快速、准确,能应用于食品中菠萝成分检测。     

多重 PCR 技术同时检测四种肠道致病菌方法的建立与初步应用

目的 建立同时检测4种食源性肠道致病菌的多重PCR方法。方法 分别依据沙门氏菌(Salmonella spp) 的fimA基因、弗氏枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii) 的ldh基因、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) 的idsC基因、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda) 的fimA基因设计4对特异性引物, 并对多重PCR反应条件进行优化。结果 建立的多重PCR方法具有结果可靠、灵敏度高、方便快捷的优点。结论 本研究为研发快速检测以上4种食源性肠道致病菌的试剂盒提供了重要技术保障。     

2017年沙门氏菌能力验证的结果与分析

目的 验证塔里木大学分析测试中心对国家食品安全风险监项目中沙门氏菌检测的技术水平。 方法 实验样品前处理方式按照考核方作业指导书要求进行处理, 沙门氏菌分离鉴定的能力验证工作按照GB4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物检验 沙门氏菌检验》并结合作业指导书进行操作。将生化鉴定结果符合沙门氏菌阳性特征的样品进行血清学鉴定及分型。结果 3 个样品中, 样品1 检出斯坦利沙门氏菌,样品2 检出肯塔基沙门氏菌, 样品3 未检出沙门氏菌, 3 个样品能力验证结果均与组织方一致。结论 通过此次能力验证, 本测试中心的微生物检验能力和沙门氏菌检测技术水平均得到了有效验证和提高, 提升了本实验室的检测能力和可信度。     

多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

食源性致病菌的多重PCR检测技术是指能够同时扩增得到同种或多种致病菌的不同基因片段的技术。因该技术特异、灵敏且分析效率高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测工作中。本文介绍了多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究近况,并对影响因素及存在的问题进行了阐述。