重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究

采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽（GSSG）加入时间对复性效果的影响.结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系（先加GSSG的含2 mol·L-1尿素的稀释复性缓冲溶液）时,复性纯化后Onconase含量和回收率明显高于醋酸沉淀复性法.     

重组蛇毒纤溶酶Fibrolase的复性

将Fibrolase基因克隆入表达载体pET25b(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%左右. 比较了直接稀释法、流加稀释法和透析法的复性效率,同时研究了温度、pH 值、初始蛋白浓度、复性液中盐酸胍浓度和氧化/还原环境等对复性的影响, 得到了较为适宜的复性条件. 结果表明,采用流加稀释复性,并在4℃, pH 8.5, 1.5 mol/L盐酸胍, 1 mmo1/L GSSG, 2 mmo1/L GSH, 初始蛋白浓度10 mg/mL及稀释体积为50倍时,复性效率最高. 重组Fibrolase蛋白在复性和纯化后的收率可达25%左右.     

重组人载脂蛋白A-I_((米兰变体))的复性及纯化

目的　从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法　包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果　经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论　本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 ,并且有望放大至工业生产规模     

应用反向亲和层析纯化基因工程产品

本文以ｒＩＬ6的纯化为例进行实验。用超声破碎的方法提取出菌体蛋白粗提物和非相关包涵体杂质蛋白(ｒＩＬ2包涵体),进而用常规免疫法制备兔抗菌体蛋白和包涵体杂质蛋白抗血清。从抗血清中用亲和层析法分离出抗菌体蛋白和包涵体杂质蛋白的特异ＩｇＧ,然后偶联ＣＮＢｒ激活的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ4Ｂ,制成抗菌体蛋白ＩｇＧ和抗包涵体杂质蛋白ＩｇＧ的亲和层析柱,即反向亲和柱Ⅰ和反向亲和柱Ⅱ。将反向柱Ⅰ和反相柱Ⅱ分别用01ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓＨＣ1(ｐＨ80)平衡,用8ｍｏｌ/Ｌ尿素溶液溶解包涵体,稀释复性后经过反向柱Ⅰ纯化,ｒＩＬ6含量达到79%…     

重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的纯化与复性研究

目的纯化、复性大肠杆菌表达的vMIPⅡ包涵体蛋白。方法用8molL尿素缓冲液变性溶解vMIPⅡ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除SDS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。结果重组vMIPⅡ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。结论已获得了重组vMIPⅡ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。     

重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性

将携带重组瑞替普酶(reteplase, rt-PA)的质粒成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)后,诱导表达获得包涵体,考察了诱导剂浓度、培养温度和培养时间等条件对目标蛋白表达量的影响。在此基础上,对高效表达的rt-PA包涵体体外复性过程进行了详细研究。首先利用单因素实验考察了复性液pH、GSH浓度、GSH/GSSG比例、蛋白浓度等各种复性条件对复性效果的影响;并结合正交实验设计,进一步研究了高蛋白浓度下复性后rt-PA酶活变化情况。以0.2 mmol·L^-1 IPTG诱导,在33℃下培养6 h,每升发酵液约可获得1.7 g粗制包涵体。适宜的复性条件为蛋白浓度50 mg·ml^-1,pH 10.0,GSH浓度1 mmol·L^-1,GSH/GSSG比例8,复性收率为87.2%。影响高蛋白浓度下rt-PA复性的关键因素为复性液初始pH及GSH浓度,在800 mg·ml^-1蛋白浓度下复性后rt-PA比活可达7.54×10⁴ IU·mg^-1,荧光光谱分析结果表明复性后rt-PA恢复了其天然态结构。     

原核表达HPVl6L1蛋白的变性、纯化及复性效果评价

目的 探讨原核表达HPVl6 L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价.方法 将重组质粒PET28a-L1转化E.coli BL21(DE3).经放大培养诱导表达后,收集菌体.超声破碎后提取包涵体.并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性.经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价.结果 LI蛋白在8 tool/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞.免疫家兔后,可产生高滴度的抗体.结论 复性的HPVl6 LI蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPVl6预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础.     

反相色谱法研究人粒细胞集落刺激因子的离子交换色谱复性和稀释复性

以反相色谱分析为主要手段,结合活性测定,研究了以包含体形式表达的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的稀释复性和离子交换色谱复性. 建立了L-精氨酸离子交换复性蛋白质的方法,将变性、还原的rhG-CSF吸附到高浓度变性剂平衡的离子交换色谱柱上,用L-精氨酸作洗脱剂进行梯度洗脱并同时脱除变性剂,实现了rhG-CSF的复性. 与稀释复性相比,色谱复性的rhG-CSF处于一种中间状态,呈现快速而不同步的动力学特点,这与色谱复性的梯度洗脱及固定相的吸附有关. 同时发现了对复性峰进一步稀释并且温育则可以提高其活性的新现象.     

Purification and renaturation of recombinant human lymphotoxin (tumour necrosis factor beta) expressed in Escherichia coli as inclusion bodies

High level expression of recombinant human tumour necrosis factor β (rh TNF-β) in Escherichia coli results in the formation of two portions of protein, namely soluble active protein and insoluble protein which is inactive and aggregates in the form of inclusion bodies (IBs). In this study, a procedure for purification and renaturation of rh TNF-β from inclusion bodies has been designed and verified experimentally with a product purity of more than 90% and a recovery of about 30%. The procedure includes washing of IBs with specific wash buffer (Triton X-100/EDTA/lysozyme/PMSF), their solubilization with 8 mol dm^?3 alkaline urea, purification with ion-exchange columns, refolding with renaturation buffer and finally concentration and desalination with an ultrafiltration membrane. The characteristics of the renatured protein were identical with those of purified protein from the soluble fraction as demonstrated by (1) SDS-PAGE, (2) cytotoxic activity on mouse L929 cells, (3) N-terminal amino acid sequence, and (4) gel filtration chromatography.     

免疫毒素ScFv(anti HER2)-PE38的复性与纯化

目的建立免疫毒素ScFv(anti HER2)-PE38的分离纯化工艺。方法免疫毒素ScFv(anti HER2)-PE38变性后,进行金属螯合柱层析复性和纯化,再用分子筛层析进行精纯,SDS-PAGE分析纯化产物。结果包涵体形式存在的免疫毒素ScFv(anti HER2)-PE38以8 mol/L尿素溶解效果较好;当复性梯度为稀释液从0到100%,共用时150 min,流速为2 ml/min时,复性效果较好,复性后的目的蛋白纯度可达95%以上;以凝胶柱Superdex 200进行分子筛层析效果较好,纯化产物的纯度可达98%以上。结论已建立了免疫毒素ScFv(anti HER2)-PE38的分离纯化工艺,为进一步的研究奠定了基础。     

重组羧肽酶原B的复性及纯化

目的　建立重组羧肽酶原B复性方法及活性羧肽酶B的纯化方法。方法　重组大肠杆菌发酵后 ,表达的羧肽酶原B包涵体经洗涤、变性 ,采用凝胶过滤的方法对其进行复性及纯化。所得的复性液经Trypsin酶解后 ,采用DEAE FF阴离子交换层析进行羧肽酶B的分离纯化 ,并采用SDS PAGE检测纯度。结果　经凝胶过滤后得到了复性和纯化的羧肽酶原B包涵体 ,在蛋白终浓度相同的情况下 ,复性效率比稀释复性提高了 5 0 % ,经DEAE离子交换柱一步纯化 ,得到了活性羧肽酶B ,纯度达到 90 %以上。以Hippuryl -L arg为底物测活 ,得到的活性酶的比活为 15 0u mg。结论　所建立复性方法及纯化方法为进一步的研究奠定了基础。