甲基苯丙胺人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用化学法合成甲基苯丙胺人工抗原,将此抗原免疫新西兰大白兔制备抗甲基苯丙胺多克隆抗体,利用EDC法将甲基苯丙胺人工抗原与蛋白质载体BSA偶联,经蛋白质电泳以及紫外扫描检测,证明甲基苯丙胺人工抗原合成成功.用间接酶联免疫检测法检测,证明制备得到了高效价的甲基苯丙胺多克隆抗体血清,且与甲基苯丙胺人工抗原具有高特异性反应,可用于甲基苯丙胺免疫学检测方法的研究。     

玉米赤霉烯酮全抗原的合成及鉴定

目的合成玉米赤霉烯酮(ZEN)的全抗原。方法将烯醇化的ZEN与阳离子化的载体蛋白(BSA)偶联,制备高特异性的全抗原,用高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF检测偶联物及载体蛋白的分子量,用商品化的ZEN免疫试剂盒对偶联物进行棋盘滴定验证。结果全抗原及载体蛋白BSA的分子量分别为69693.5 Da、66297.7 Da,平均每个BSA连上的ZEN分子个数为10.68个;平均每个OVA上连上的ZEN分子个数为5.32个;偶联物与免疫试剂盒中ZEN的抗体呈阳性反应。结论合成的ZEN全抗原为ZEN抗体的制备及免疫学方法的建立奠定了基础。     

呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法.方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原.免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD),并检测抗体的特异性.胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性.结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD 0.07 μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应.制备的胶体金试纸条灵敏度5 μg/L.结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条.     

3种真菌毒素(ZEN、DON及T2)完全抗原的合成与鉴定

目的:合成玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和T2 3种真菌毒素的完全抗原。方法:将ZEN半抗原、DON及T2与阳离子化的载体蛋白(BSA和OVA)偶联,制备高特异性的完全抗原。用高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)检测偶联物及载体蛋白的分子质量,用商品化的ZEN、DON和T2单克隆抗体对偶联物进行免疫滴定验证。结果:平均每个BSA偶联上的ZEN、DON和T2的分子个数分别为20.81,6.03,4.92个,平均每个OVA偶联上的ZEN、DON和T2分子个数分别为7.17,3.05,2.80个,偶联物与ZEN、DON及T2的抗体呈阳性反应。结论:合成的ZEN、DON及T2完全抗原为3种毒素抗体的制备及免疫学方法的建立奠定了基础。     

检测三聚氰胺胶体金免疫层析试验的建立

采用混合酸酐法制备三聚氰胺-OVA偶联抗原,胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体,建立了检测三聚氰胺的胶体金免疫层析试验.该试验具有较好的敏感性,最低可检测50μg/L的三聚氰胺.胶体金免疫层析试验对原料奶和奶粉样品中三聚氰胺的最低检测量分别为250μg/L和1000μg/L,可初步应用于基层实验室快速筛查检测.     

膝沟藻毒素GTX 2,3完全抗原的合成与鉴定

膝沟藻毒素GTX 2,3是一类小分子物质,不具备免疫原性,欲制备其免疫血清及抗体,则必须与偶联剂及载体蛋白偶联形成完全抗原。运用乙二醛作为偶联剂,分别与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)合成免疫抗原GTX 2,3-glyoxal-BSA和检测抗原GTX 2,3-glyoxal-KLH,并对经超滤纯化浓缩后的偶联产物进行BCA蛋白浓度测定、全波段紫外扫描、变形SDS-PAGE凝胶电泳和抗原免疫原性的鉴定。结果表明,免疫抗原和检测抗原的蛋白质量浓度分别为8.52 mg/m L和5.72 mg/m L;经全波段紫外扫描和变形SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,半抗原GTX 2,3-乙二醛与载体蛋白BSA、KLH偶联成功,偶联比约为1︰16和1︰20,并制备出纯度较高的免疫抗原;用制备的人工抗原GTX 2,3-glyoxal-BSA对Balb/C小鼠进行免疫,通过间接ELISA检测6免后小鼠血清效价达到1︰20 000。成功制备了具有较强免疫原性的膝沟藻毒素GTX 2,3人工抗原。     

隐孔雀石绿半抗原与全抗原设计、合成及鉴定

从偶联位点、偶联活性基团的性质及半抗原的合成与偶联方法分析,设计了系列不同结构的半抗原和人工抗原及其合成方法.以N,N-二甲基苯胺、苯甲醛衍生物为原料,Amberlyst 15树脂为催化剂,在温和条件下合成出3种隐孔雀石绿半抗原;进一步采用活泼酯和重氮化法分别将获得的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联,形成相应全抗原.半抗原和全抗原分别经减压硅胶柱色谱及透析纯化后,采用质谱、核磁共振及紫外扫描光谱等分析手段进行了鉴定,结果表明半抗原及免疫全抗原均合成成功,满足了进一步免疫、筛选高质量抗体和建立检测方法的需要.同时,采用分子模拟手段对抗原表面半抗原决定簇的前线分子轨道分布情况进行了仿真模拟分析,讨论了前线轨道的分布可能对抗体特性造成的影响,为进一步的半抗原构效关系研究提供理论支持.     

莱克多巴胺和土霉素人工抗原的合成及鉴定

研究莱克多巴胺和土霉素免疫抗原的制备。实验中用碳二亚胺法将莱克多巴胺(ractopamine,RAC)与载体蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联,制备完全抗原;采用混合酸酐法将土霉素(oxytetracycline,OTC)与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原,并对合成产物进行表征。紫外扫描对合成产物RAC-BSA、OTC-BSA进行鉴定结果显示偶联成功,经重氮化后利用混合酸酐法制备完全抗原的偶联比为5:1;经衍生后利用碳二亚胺法制备RAC完全抗原偶联比为7:1。利用制备的免疫原免疫兔子可以获得相应的抗体。     

黄曲霉毒素B1完全抗原构建中结合位点研究

通过衍生化反应,合成了AFB1羧甲基活化物,然后利用碳二亚胺法合成AFB1-O-BSA偶联物,构建AFB1完全抗原,并通过多种光谱和质谱对合成完全抗原过程中偶联比和结合位点进行研究。通过荧光光谱在分子水平上探讨AFB1与BSA载体蛋白的偶联机制及偶联反应对BSA的构象影响,推测黄曲霉毒素和牛血清白蛋白反应的结合部位,同时发生在BSA的酪氨酸残基和色氨酸残基上,使得BSA疏水性增加,肽链伸展程度降低。     

河豚毒素人工抗原的制备及其免疫原性鉴定

目的:选择血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)分别作为载体蛋白与河豚毒素(TTX)进行偶联制备人工抗原,并对合成结果进行鉴定。方法:通过甲醛法将TTX分别与大分子载体蛋白,即血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联。利用紫外扫描法、电泳法对偶联产物进行鉴定,并对6周龄Balb/c雌性小鼠免疫注射检测其免疫原性。结果:紫外扫描显示偶联抗原较载体蛋白有轻微的红移现象出现,且经过琼脂糖凝胶及SDS-PAGE 2种方法电泳检测后发现,载体蛋白较人工抗原之间迁移率均不相同;对免疫小鼠进行间接酶联免疫吸附试验(iELISA)及间接竞争酶联免疫吸附试验(icELISA)联用检测其多抗血清效价及特异性,经过共计6次免疫后的效价能达到1:40w,且能有效抑制TTX。结论:河豚毒素人工抗原制备成功且具备良好的免疫原性。     

环丙沙星人工抗原的合成及鉴定

通过化学方法制备了环丙沙星的免疫抗原和包被抗原;分别采用碳二亚胺(EDC)法和氯甲酸乙丁酯法把环丙沙星与BSA进行了偶联制备了人工免疫抗原CIP-BSA,EDC法制备了包被抗原CIP-OVA,经PAGE、紫外分光光度法测定了人工合成抗原的偶联比,EDC法和氟甲酸乙丁酯法制得的CIP-BSA两分子结合比率分别为4:1和11:1,CIP-OVA中两分子结合比率为12:1.这为环丙沙星单克隆抗体的制备奠定了基础.     

甲胺磷人工抗原的合成与鉴定

采用重氮法直接用甲胺磷连接牛血清白蛋白合成了人工抗原。通过鉴定,该人工抗原的紫外吸收光谱呈现出与半抗原、载体蛋白的紫外吸收光谱均不同的吸收峰;红外光谱图中也同时呈现了半抗原与载体蛋白的特征吸收带;并测得人工抗原中甲胺磷与载体蛋白的结合比为15∶1,表明该人工抗原合成成功。     

多效唑人工抗原的合成与鉴定

为合成新的、有效的多效唑人工抗原,采用琥珀酸酐法对多效唑小分子进行结构修饰,以获得含羧基的多效唑半抗原。将纯化后的半抗原分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白经N-羟基琥珀酰亚胺活泼酯法偶联制备免疫原和包被原。采用质谱、红外光谱、核磁共振氢谱对多效唑半抗原的结构进行鉴定;采用紫外光谱及高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对偶联物的结构进行鉴定。结果显示成功合成出多效唑人工抗原,为其抗体的制备和免疫学方法的构建奠定了前期研究基础。     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

人工抗原苯并芘的化学合成与分析

以苯并芘（benzo(a)pyrene,BaP）为起始反应物,通过碘代、Heck偶联两步化学反应合成苯并芘的羰基衍生物,再经肟化反应将羰基羧基化,采用活化酯法将羧基化半抗原与载体蛋白（牛血清蛋白）进行偶联,制备苯并芘的人工抗原。采用红外光谱（infrared spectroscopy,IR）、核磁共振波谱（nuclear magnetic resonancespectrum,NMR）和质谱（mass spectrometer,MS）对苯并芘中间产物进行表征,并用紫外扫描的方法对人工抗原进行鉴定。本实验成功羧化了苯并芘,并成功构建人工抗原,苯并芘与载体蛋白的偶联比为28∶1。     

莱克多巴胺人工抗原及抗体的制备

莱克多巴胺是一种禁用β-兴奋剂,建立莱克多巴胺药残的快速检测方法是实现对其进行有力监控的有效途径,而莱克多巴胺抗体是快速免疫检测法的基本试剂。本实验用全新的方法研究了莱克多巴胺免疫原的合成,采用对氨基苯甲酸(ABA)和1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)将莱克多巴胺分别和cBSA、cOVA偶联,合成了莱克多巴胺的免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用免疫原免疫新西兰大白兔,获得了高灵敏度和特异性的莱克多巴胺多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的IC50值为4.34ng/ml,所得多克隆抗体效价达到102400。     

大分子葡聚糖-牛血清蛋白抗原偶联物的制备与表征

用还原胺化法制备大分子葡聚糖-牛血清蛋白(BSA)拟糖蛋白抗原,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝和过碘酸-品红两种染色方法验证偶联物的生成。考察不同反应条件(葡聚糖T40的氧化度,偶联pH,氧化葡聚糖和蛋白质的比值,偶联时间)对偶联反应的影响。确定拟糖蛋白抗原的最佳偶联条件为:葡聚糖T40/氧化剂NaIO4=1/120(物质的量比),偶联溶液pH8.0,葡聚糖T40/BSA=1/1(物质的量比),偶联时间24h。并将此反应条件用于T10和T100拟糖蛋白抗原的合成。     

3-氨基-2-嗯唑烷酮半抗原、人工抗原的合成及鉴定

以2,4-二硝基氟苯为衍生剂,建立了3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的高效衍生方法,成功获得了衍生物F-AOZ,并进一步通过硝基的选择性还原合成了新的半抗原AM-AOZ,经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和核磁共振(NMR)鉴定F-AOZ与AM-AOZ合成成功;采用重氮化法和戊二醛交联法将半抗原AM-AOZ分别与牛血清蛋白BSA和卵清白蛋白OVA进行偶联,合成了AOZ免疫原和包被原,经紫外吸收法进行成功鉴定;同时,分别采用紫外扫描法和三硝基苯磺酸法(TNBS)测定偶联比。另外,采用分子模拟手段对抗原表面半抗原决定簇的前线分子轨道分布情况进行了模拟分析,讨论了前线轨道的分布对可能获得的抗体特性的影响,为进一步制备高质量抗体提供理论支持。     

重金属汞螯合物人工抗原的合成与鉴定

以重金属汞为起始物质,将其离子化为二价汞,与双功能螯合剂谷胱甘肽(GSH)螯合后,获得半抗原,然后将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)进行偶联,获得完全抗原。实验对各步骤的反应条件进行优化,采用紫外光谱、凝胶电泳对产物进行表征,成功制备了汞-GSH-BSA完全抗原。为计算完全抗原中重金属和载体蛋白的偶联比,采用石墨炉原子吸收法测定产物中重金属汞的含量,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定抗原中载体蛋白的含量,所制备的免疫原中汞和蛋白的偶联比是9:1。Hg-GSH-BSA的成功合成是制备可识别重金属汞螯合物抗体的基础。