玉米中转基因成分的定性PCR检测

利用改良CTAB法提取玉米产品的基因组DNA,应用PCR检测方法,并以玉米特异性内源基因IVR为内参,花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S启动子）、农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）为靶基因检测玉米中是否存在转基因成分。实验结果表明,有些玉米样品中存在转基因成分,表明市场上存在未经标识的转基因玉米及其加工品。     

玉米中转基因成分的定性PCR检测

利用改良 CTAB 法提取玉米产品的基因组 DNA,应用 PCR 检测方法,并以玉米特异性内源基因 IVR 为内参,花椰菜花叶病毒 35S 启动子(CaMV35S 启动子)、农杆茵胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)为靶基因检测玉米中是否存在转基因成分.实验结果表明,有些玉米样品中存在转基因成分,表明市场上存在未经标识的转基因玉米及其加工品.     

转基因食品的快速PCR鉴定

用十六烷基-二甲基-乙基-溴化铵(CTAB)法快速高效地从样品中提取了可供分析的基因组DNA，经PCR扩增，鉴定了含有35S启动子和NOS终止子的转基因样品，该方法的灵敏度可达0．1％，并且具有很好的稳定性。     

玉米转基因成分的非同源模板竞争定量PCR检测

建立了玉米转基因成分中35S启动子非同源模板的竞争定量PCR检测系统．竞争定量PCR的关键问题是内标物的制备．实验中非同源模板的构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严紧型扩增，回收预期DNA片段并将其构建到T-easy载体上．通过调整非同源模板浓度使竞争物PCR产物亮度与1％GMO玉米的亮度相同，从而确定转基因玉米的检出限为1％．然后以确定的内标物浓度与不同含量的GMO玉米样品进行竞争定量PCR反应，以此进一步确定样品中GMO的含量范围．     

玉米转基因成分的非同源模板竞争定量PCR检测

建立了玉米转基因成分中35S启动子非同源模板的竞争定量PCR检测系统.竞争定量PCR的关键问题是内标物的制备.实验中非同源模板的构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严紧型扩增,回收预期DNA片段并将其构建到T-easy载体上.通过调整非同源模板浓度使竞争物PCR产物亮度与1%GMO玉米的亮度相同,从而确定转基因玉米的检出限为1%.然后以确定的内标物浓度与不同含量的GMO玉米样品进行竞争定量PCR反应,以此进一步确定样品中GMO的含量范围.     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为开发一种快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据引物设计原则在病毒基因组序列保守区设计了一对PEDV特异性引物,通过系统优化建立了EvaGreen实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏度和重复性进行了分析,并将该方法应用于90份临床样品检测。结果表明:该实时荧光定量PCR可以特异性地检测PEDV,对其他非靶标病毒无交叉反应,最低检测限为5 copies/μL;使用3个不同浓度的标准品进行批内和批间重复,Ct值的变异系数在2.8%以下,表明该方法重复性好;临床样品中PEDV的阳性率为48.9%。建立的实时荧光定量PCR是一种快速、准确、高度灵敏且特异的检测方法,可用于PEDV流行病学调查和临床诊断。     

三种启动子shRNA表达框的制备及其在筛选有效SiRNA中的应用

为能快速经济地获取小干扰核糖核酸 (small interfering RNA siRNA)，设计采用特异性延伸引
物和上游、下游两条通用引物，通过重叠延伸一步聚合酶链反应(PCR)法一次性快速、简捷地制备包含U6
+1、H1或tRNAVal在内的三种人小RNA多聚酶III启动子 小发夹状RNA（shRNA）表达框.用该方法制备的增
强型绿色荧光蛋白（EGFP）特异性三种启动子 shRNA表达框在转染HepG2细胞后有效地抑制了EGFP转基因
表达，其中以tRNAVal shRNA表达框抑制效果最显著，且未检测到干扰素应答基因2'5'OAS mRNA的表达，
表明该表达框可被有效转染并启动产生特异基因的RNA干扰效应，进而用于快速筛选最佳siRNA位点及其最
适搭配启动子.     

转基因食物中常见外源基因PCR检测方法的建立

通过对CTAB法、胍-氯仿法和试剂盒法三种植物基因组提取方法进行比较,筛选出回收率最大的CTAB法用于本实验样品基因组的提取。其次,以转基因作物中9种常见的外源基因序列为模板,设计出9对引物,拟扩增片段皆小于200bp以适用于深加工食品的检测,并进行了引物的特异性、灵敏度、适用性验证试验。最后,将所建立的普通PCR检测方法应用到了转基因样品的实际检测中。结果表明,所建立的针对转基因作物中9种常见外源基因的PCR检测方法特异性强、灵敏度高,相对检测限可达0.1%～0.5%,约18～90拷贝的基因组。因此,该方法可用于转基因食品及加工品中常见基因的筛选检测。     

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立

为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。     

时间分辨荧光检测组合式DNA芯片

研究了时间分辨荧光标记与检测组合式DNA芯片的方法。首先在薄玻璃片上原位合成寡核苷酸的序列片段，然后将之裁成小片，随后将带有不同DNA片段序列的小片拼接组合成组合式DNA芯片。利用4，7-二氯磺酰苯基．1，10-菲罗啉-2，9-二羧酸（BCPDA）多重标记的亲和素-生物素放大效应，建立了时间分辨荧光检测组合式DNA芯片的方法：芯片上的DNA序列经过杂交后，其互补序列末端的生物素可将多重BCPDA标记的亲和素联接，然后由BCPDA对铕离子（Eu^3＋）捕获与解离来实现杂交信号差别，并可实现对正配、单碱基错配、二及三碱基错配的时间分辨荧光信号差别的检测。对BCPDA标记的系列化合物进行了荧光性能表征，并对时间分辨荧光检测与传统荧光检测模式作了比较。     

番茄果实特异性启动子驱动下的乙肝表面抗原S基因的植物表达载体的构建

将番茄果实特异性启动子通过PCR的方法扩增出来,然后将其替代了pBIN438的CaMV35S启动子,并将乙肝表面抗原的S基因连接到载体上,以获得番茄果实特异性表达乙肝表面抗原的高效植物表达载体。     

转基因产品的PCR—ELISA液相杂交检测条件研究

确定杂交液成分，选择探讨浓度，将5′端标记生笔素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合，在PCR管中按优化后的条件（92℃，5min；55℃，5min）进行液相杂交。杂交产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面，同时在含高浓度二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）的杂交液中将非特异结合的探针解离，然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。PCR－ELISA液相杂交检测方法操作简便，特异性高，避免了繁琐的杂交程序和对人体有害的溴乙锭，适用于转基因产品及春加工食品的快速检测。     

过量表达拟南芥高亲和性磷酸载体蛋白基因提高转基因烟草对磷的吸收（英文）

磷是所有生物生长必需的大量营养元素.酸性土壤占世界可耕地面积30%以上,在酸性土壤中,大部分磷以不溶性形式存在,很难被植物吸收和利用.为了增加植物对酸性土壤不溶性磷的吸收能力,本研究利用CaMV35S启动子在转基因烟草中过量表达拟南芥高亲和性磷酸载体蛋白（AtPTI）基因.研究结果表明在酸性土壤中生长时,转基因烟草叶片磷的含量及其生物量均高于不转基因的野生型（WT）植物（对照）.转基因植物可以正常生长、开花和结实,而WT植物的开花时间提前且不能正常结果.这些结果证实在植物中过量表达AtPTI基因是提高植物吸收酸性土壤中磷及其产量的一个有效策略.     

应用间接ELISA方法定量检测转基因抗虫玉米

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原，通过抗体-抗原-酶标抗体反应，建立了间接酶联免疫吸附测定法（ELISA），以快速检测转基因抗虫玉米中的BtL表达蛋白，用建立的ELISA法对4种进口玉米实物样品进行了测定，实验结果得到了免疫印迹分析的验证，并与进口试验盒方法的定量分析结果相一致。     

无抗性选择标记的植酸酶基因转化DNA的构建

构建了无抗性选择标记植酸酶基因的转化片段DNAphyAⅡ。两侧设置了高等植物基因组DNA保守序列CAATbox，TATAbox和polyA的DNA片段（DNAphyAⅡ，5‘-CAATbox-TATAbox-CaMV35S-phyA Ⅱ-GUS-Nos-Tem-polyA-3‘)，为提高转化率奠定了分子基础，此外DNAphyAⅡ中植酸酶蛋白编码基因phyA Ⅱ前后的启动子和终止子序列，确保了phyA Ⅱ会得以正确表达。     

TaqMan-MGB探针检测人REV3L基因的毒物兴奋效应

研究低剂量紫外线照射诱导人胚肺成纤维细胞（MRC-5）REV3L基因表达量变化的毒物兴奋效应．用四氮唑盐比色法（MTT法）检测细胞增值抑制率，得到紫外线对MRC-5毒性的剂量反应关系，并对低剂量处理组（10s和20s）和高剂量处理组（30s、60s和300s）染毒细胞，采用TaqMan—MGB探针，进行荧光实时定量PCR，检测REV3L基因表达量的变化．发现低剂量处理组（20S）使REV3L基因的表达量明显增高．表明低剂量紫外线照射可以引起MRC-5细胞REV3L基因产生毒物兴奋效应．     

基于高分辨率熔解曲线分析技术鉴别杭白菊和黄山贡菊的初步研究

杭白菊和贡菊同为药茶两用的药材,种植较多,种质相近。然而两者保健功效、药用成分各有不同,饮用或入药时需加以区分,传统鉴别方法主观性强,往往难以精确区分。文章提出一种中药材分子鉴定方法,采用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM),并结合DNA条形码ITS2序列对杭白菊和黄山贡菊进行快速鉴别。以杭白菊及黄山贡菊干燥药材为样品,ITS2序列作为DNA条形码,获得ITS2序列的高分辨率熔解曲线;建立检测鉴定杭白菊与黄山贡菊的HRM-荧光定量PCR方法和杭白菊和黄山贡菊高分辨率熔解曲线模型;在HRMPCR条件下,建立杭白菊和黄山贡菊的标准化高分辨率熔解曲线图、高分辨率熔解曲线衍生差异图,并应用该方法检测市售杭白菊和黄山贡菊共10份样品。结果表明:利用高分辨率熔解曲线技术能够有效地区分开杭白菊和黄山贡菊,为进一步应用高分辨率熔解曲线分析技术鉴定中药材提供理论基础和技术依据。     

冻干奶粉样品中大肠杆菌O157和O111的检测方法

应用实时荧光PCR技术建立一种检测冻干奶粉样品中大肠杆菌的方法。通过传统培养法将大肠杆菌O157和O111分离纯化,根据大肠杆菌O157和O111的两对特异性基因rfbE和wbdl设计引物和探针,进行RT-PCR检测;由于该大肠杆菌可能是产志贺毒素大肠杆菌,对STEC的特异性毒力基因stx1、stx2b、eae设计引物和探针并检测。结果表明,该冻干奶粉样品中含有大肠杆菌O157和O111,且致病菌O157检出毒力基因stx1、stx2b、eae,即产志贺毒素与黏附素,致病菌O111检出毒力基因eae,不产志贺毒素而产黏附素。该方法能准确分离大肠杆菌O157和O111,利用实时荧光PCR的高灵敏度和特异性快速检验致病菌及其特异性毒力基因。     

SEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析

通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal entero-toxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列sec2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124sec2t,采用"珠磨法"将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10μg/mL Zeomy-cin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-sec2t.Southern blot和Western blot分析表明,sec2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-sec2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-sec2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生;与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.     

PCR仪温度场热模型的研究与验证

为衡量聚合酶链反应（PCR）仪能否实现基因扩增的目的,基于传热学原理,建立PCR仪热循环系统的温度场热模型.通过有限元仿真方法对PCR仪96孔样品块温度场进行了定量描述,并绘制出单个样品孔和反应试剂的温度变化曲线.在此温度变化曲线的基础上,得到反应试剂温度与样品孔温度的关系曲线,由样品孔温度计算得出同一时刻的反应试剂温度.通过高精度温度检测系统,对PCR仪样品孔与反应试剂热循环过程中的温度进行了测量实验,所得到的样品孔与反应试剂的实际温度曲线证明了该仿真热模型的合理性.该模型为PCR仪热循环系统的热性能分析提供了理论基础和实验依据.