Lactococcus lactis谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质

采用溶菌酶处理、超声破碎、硫酸铵分级、3次DEAE SepharoseCL 6B层析、SephacrylS 200凝胶过滤等手段,从乳酸菌细胞中分离纯化得到谷氨酸脱羧酶(GAD;EC4.1.1.15).纯化酶的比活力为14.4U/mg,纯化倍数31,回收率3.8%,SDS PAGE得到亚基的相对分子质量为65000.L 谷氨酸是测试的18种氨基酸中的惟一作用底物,表明乳酸菌GAD具有高度的底物专一性.酶在pH值3.6～5.4时具有活性,pH值4.7时活性最高,pH值6.0以上时没有活力.耐热性实验表明,pH值4.7条件下处理5h后,60℃时该酶仍能保持80%以上的活性,80℃以上迅速失活,由Lineweaver Burk作图得到的GAD的Km值为1.9mmol/L.     

蛋清溶菌酶的提取及其酶学性质探究

采用阳离子交换法-超滤法协同分离提取蛋清中溶菌酶,首先通过单因素试验和Box-Behnken试验,优化蛋清中溶菌酶的提取工艺,然后对其酶学性质进行探究。结果表明:在树脂用量为蛋清滤液的24.2%,NaCl浓度1.00 mol/L,蛋清滤液pH 9.10,洗脱时间62.61 min时,溶菌酶经超滤离心后测得纯度为96.36%,比活力为23 718.61 U/mg。对所得溶菌酶酶学性质的研究表明:溶菌酶最适pH 7.0,在pH 4.0～7.0范围内稳定性较好,最适反应温度60℃,低温下热稳定性良好,在较高温度下酶活下降较快。Na~+和Ca~(2+)对酶有较强激活作用,K~+有一定激活作用,Mg~(2+)和Mn~(2+)对酶活影响不大,而Zn~(2+)对酶有明显抑制作用。甘油、Tween20、Tween40、Tween80等表面活性剂均对溶菌酶有抑制作用,其中甘油抑制效果最强。本研究结果对溶菌酶的工业化提纯和生产具有重要的意义。     

3种取代度的羧甲基纤维素对溶菌酶抑菌活性影响的研究

溶菌酶活性易受食品组分和环境因素影响。研究了3种取代度的羧甲基纤维素与溶菌酶之间的静电相互作用,考察在不同温度、pH值和离子强度条件下,羧甲基纤维素对溶菌酶抑菌活性的影响。结果表明:取代度为0.7和0.9的羧甲基纤维素可提高溶菌酶活性,取代度为1.2的可降低溶菌酶活性。由于取代度越高,与溶菌酶的静电相互作用越强,溶菌酶的抑菌性随着羧甲基纤维素取代度的增加而逐渐降低。由于溶菌酶与羧甲基纤维素相互作用形成较大粒子,复合物中溶菌酶的热稳定性、pH稳定性均有所降低。Na~+会抑制溶菌酶的酶活且会使溶菌酶/羧甲基纤维素复合物解离,酶活逐渐恢复至单独溶菌酶酶活。并且进一步通过对2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和2种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、阴沟肠杆菌)的抑菌圈实验证明,羧甲基纤维素与溶菌酶复合后,低取代度的羧甲基纤维素能提高对革兰氏阳性菌的抑制作用;而且,和游离溶菌酶比较,羧甲基纤维素/溶菌酶复合物对大肠杆菌抑制作用增强。     

重组海参溶菌酶理化特性及生物活性的初步研究

将构建好的重组海参溶菌酶毕赤酵母菌株进行诱导表达,用CM52-纤维素阳离子交换柱分离得到电泳纯的重组海参溶菌酶.利用浊度法测定该酶的活性,滤纸片液体扩散法测定其抑菌谱.结果显示,重组海参溶菌酶的最适pH值为6.5,最适温度为35℃,在pH5.0～7.5、50℃以下有较好的稳定性.抑菌谱测定结果显示重组海参溶菌酶对6种指示菌均表现出抑菌性,尤其对副溶血弧菌的抑制作用最强.上述结果均与天然海参溶菌酶一致.     

生菜(Lactuca sativa L.)多酚氧化酶特性研究

以散叶生菜为原料,研究提取液用量、底物浓度、反应体系pH值和温度、抑制剂对生菜多酚氧化酶(PPO)活性的影响。结果表明:以邻苯二酚为底物,生菜PPO在420nm波长下吸光度最大;磷酸缓冲液(mL)与生菜质量(g)比为1.5∶1时,提取液中PPO活性较强;最适pH值为8.0、最适温度为30℃、最适底物浓度为0.3 mol/L。抑制剂对PPO酶抑制效果依次为抗坏血酸﹥柠檬酸﹥NaCl;此外,生菜叶脉中PPO活性为叶片中PPO活性的5.72倍。     

玉米胚谷氨酸脱羧酶的性质

研究了玉米胚谷氨酸脱羧酶(GAD)的性质。结果表明:玉米胚GAD的最适温度为40℃,最适pH为5.7,其热稳定较差,60℃下保温1 h,酶活下降至39%,85℃时酶完全失活,而此酶在pH4.5～7.5可保持80%以上的酶活。玉米胚GAD对Glu的Km值和Vmax分别为51.87 mmol/L和1.807 mg/min。另外,KCl、NaCl和SDS对玉米胚GAD活性有较大的抑制作用,而Ca2+对此酶的活性有较强的激活作用,可提高底物与玉米胚GAD的亲和力。     

从鸡蛋壳中提取溶菌酶的工艺研究

鸡蛋壳中含有一定量的溶菌酶,本文利用聚丙二烯酸富集的方法从蛋壳中提取溶菌酶,抽提溶液是提取溶菌酶的关键,通过对抽提的温度、NaCl的浓度、pH等条件进行了筛选,确定了最佳的抽提条件：当利用新鲜的蛋壳在NaCl浓度为0．75％。温度30～40℃,pH为6．0的条件下抽提率可达到0．116％。     

微生物弹性蛋白酶催化动力学特性研究

研究了弹性蛋白酶的酶学性质与酶促反应动力学.研究表明,弹性蛋白酶的作用最适pH值与所用缓冲体系有关,在硼砂-硼酸缓冲体系中,最适pH值为7.8,而在Tris缓冲体系中,最适pH值为8.48;酶的作用最适温度为50℃,当温度高于60℃时,酶活性下降辐度较大,差异极显著.酶在pH3～7即酸性条件下,酶活较低,而在pH7～12时酶活较高,且趋于稳定.大部分金属离子对酶的活性有抑制作用,尤其是Ba+、Ca+、Al+和Cu+等金属离子可使酶的活性直线下降,而钠离子对酶的活性没有明显影响.采用Lineweaver-Burk方法,获得酶催化动力学参数Vmax=0.09512U/mL,km=0.00741m/ml,应用Michaelis-Menten方程求得弹性蛋白酶以弹性蛋白为底物的催化动力学方程为V=0.09512[S]/0.00741+[S].     

pH值对芽孢皮层裂解酶活性及结构的影响

为探究酸性pH值条件抑制芽孢萌发的机理,研究了不同pH值处理对芽孢皮层裂解酶(CwlJ)的活性和结构的影响。采用傅立叶红外光谱法与荧光光谱法来分析芽孢皮层裂解酶(CwlJ)的二、三级结构与酶的活性之间的关系。实验所采用的pH值为3、5、7、9、11,结果表明:1)p H值为3、5时,随着时间的推移,芽孢皮层裂解酶(CwlJ)被激活,活性很高;2)酶的活性与其二级结构域中的α-螺旋相对含量紧密相关;当pH值从3增加到5时,α-螺旋相对含量不断增大,由36.15%增加到37.29%,当pH值从5增加到7时,α-螺旋相对含量基本不变,当pH值从7增加到11时,α-螺旋相对含量不断的减小,即在pH值为3～5之间酶可能被激活;3)随着pH处理条件的改变,pH值为5的荧光强度最强,内部蛋白质完全展开,空间结构更加松散扩张,三级结构更加稳定。结果表明,在酸性pH值条件下,皮层裂解酶(CwlJ)的结构稳定,活性高,故推测酸对芽孢萌发的抑制作用不是因为其抑制了皮层裂解酶的活性。     

膨化米糠中多糖的酶法提取研究

研究了酶解温度、酶解时间、酶用量、pH值对膨化来糠中多糖的提取得率及活性的影响.试验表明.各因素对提取得率影响大小依次为pH值、酶解温度、酶解时间、酶用量;对米糠多糖活性影响最大的是pH值,在酸性或碱性环境下提取的多糖活性都低.建立的回归模型较好地拟合了多糖得率与各因素之间的关系.结合多糖得率及活性测定,利用期望函数途径进行模拟选优,并进行验证.