古生菌来源耐热肌氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质

由于目前大部分肌氨酸氧化酶(sacrosine oxidase, SOX)热稳定性差、失活机理研究不深入,使其在医疗和食品工业等领域的实际应用中受限。该研究通过筛选与挖掘一种热稳定性优异的肌氨酸氧化酶,以达到拓宽其应用前景与应用潜力的目的。根据预测,将来源于古生菌Archaea HR32中肌氨酸氧化酶在Bacillus subtilis WB600中异源表达,并对其酶学性质进行考察。重组蛋白rSOX大小约为42 kDa,二级结构由35.0%α-螺旋、11.1%β-折叠、23.3%β-转角及31.6%无规则卷曲组成,T_m和ΔH为92.13℃和1 070 kJ/mol。以肌氨酸为底物时,最适pH为8.0,最适温度为70℃,80℃下半衰期为12 h,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为1.17 mmol/L、74.59 min^-1、63.78 L/(mmol·min)。常见有机溶剂对rSOX活性影响不大,金属离子则对rSOX有不同程度的促进或抑制作用。另外,rS...     

菌株LYH18发酵条件优化及肌氨酸氧化酶的分离纯化

以海洋来源的芽孢杆菌（Bacillus sp.）LYH18为出发菌株,优化其发酵条件,并对其所产肌氨酸氧化酶（SOX）进行分离纯化。结果表明,其最适产酶发酵条件为肌酸添加量1.0%,酵母膏添加量0.8%,MgSO4·7H2O添加量0.05%,KH2PO4添加量0.2%,K2HPO4添加量0.05%,初始pH值为7.0,培养温度25 ℃,装液量40 mL/100 mL。在此最佳发酵条件下,肌氨酸氧化酶酶活为4.45 U/mL。通过十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析肌氨酸氧化酶,其纯化后的分子质量为43 kDa。     

巨大芽孢杆菌酯酶的克隆、表达及催化性质研究

将重组质粒pET30a-bme转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3),在终浓度0.2mmol/L的IPTG诱导下,实现BME功能性表达,利用亲和层析纯化表达产物,并研究其酶学性质。分离纯化的重组酯酶经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,其分子量约为41.5 kDa。该酶最适反应温度和pH分别为70℃与7.5,比酶活为200 U/mg。BME能耐受低浓度(1mmol/L)的Na+,Zn2+,Ca2+,Mg2+,Mn2+和EDTA等,但较高浓度(5 mmol/L)的Na+,Zn2+,Ca2+对酶活有一定抑制作用。体积分数在0%~80%范围,BME对甲醇具有良好的耐受性,而体积分数在50%时Triton X-100对其酶活有一定抑制作用。同时发现该酶对4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有立体选择性,拆分反应的转化率和底物e.e.值分别为50%和70%。     

Bacillus altitudinis SYBC hb4碱性β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质的研究

为获得耐碱性β-葡萄糖苷酶,进一步研究碱性β-葡萄糖苷酶的酶学性质。从实验室已有蜂蜜中筛选出一株耐碱性的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis SYBC hb4,根据Bacillus altitudinis SYBC hb4中β-葡萄糖苷酶(bglA)基因序列设计一对引物,通过PCR扩增技术,获得β-葡萄糖苷酶基因(bglA),将扩增后的bglA与质粒pColdII构建重组表达载体pColdII-bglA,并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。重组表达的β-葡萄糖苷酶酶活可达12.40 U/mL;该重组β-葡萄糖苷酶最适反应温度为60℃;最适反应pH值为pH 8.0;5 mmol/L的Mg~(2+)可使酶活提高50%左右。本实验所获得的碱性β-葡萄糖苷酶比已报道的重组酶在碱性条件下稳定性更好。     

Bacillus sp.肌氨酸氧化酶的脱辅基与重构

在肌氨酸氧化酶脱辅基的效果不够理想的情况下,利用不含辅基的重组肌氨酸氧化酶包涵体进行透析复性,以期重现SOX酶与辅酶的复合。研究表明,肌氨酸氧化酶(SOX)包涵体较适合的复性条件为:酶蛋白质量浓度0.3 g/L,透析液pH 8.5,温度4℃,氧化还原值(GSH/GSSG)为2,复性时间为24 h。作者还比较了不同天然辅基与SOX蛋白的复合效果,通过圆二色性、红外光谱以及DSC热差分析,探究了天然辅基与肌氨酸氧化酶复合后对酶蛋白二级结构、比酶活及稳定性的影响。     

新型中性植酸酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及酶学性质

运用基因工程技术,将克隆到的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061新型中性植酸酶基因(GenBank登录号为HM747163)构建到表达载体pET22b(+)上,并在E.coli BL21(DE3)中进行高效表达。电泳结果表明该酶分子质量约为42kD,目的蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白30%左右。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化,酶学性质研究表明,其最适温度为60℃,最适pH值为7.0,最大酶比活力为15U/mg。60℃时以植酸钠为底物的Km值为0.30mmol/L。     

分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp.LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.0。动力学常数K_m为(179.10±20.65) mmol/L、k_cat/K_m为(5.44±0.72)...     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

谷氨酸棒杆菌表达大肠杆菌来源海藻糖酶

对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum）表达大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）来源海藻糖酶进行研究。构建重组C.glutamicum菌株Cgtrl表达E.coli BL21来源海藻糖酶。菌株Cgtrl海藻糖酶最适表达条件：诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）添加量为0.5 mmol/L,诱导温度为22℃,诱导时间为12 h。在最适表达条件下重组海藻糖酶酶活为9.1 U/mL。重组海藻糖酶酶学性质研究表明,未经纯化的重组海藻糖酶具有较好的底物特异性能,专一性水解海藻糖,海藻糖水解率在96%以上,低温条件下稳定性较好,能够长时间低温保存,最适作用温度为45℃,最适作用pH值为6.6。     

基于温控载体表达胆固醇氧化酶

胆固醇氧化酶在医药检测、食品加工、农业生产等方面都有重要的应用价值。以来源于Rhodococcus sp.的胆固醇氧化酶基因为研究对象,构建于温控表达载体p Hsh上,免去了诱导剂的使用,采用温度调控使胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中成功表达。在摇瓶水平对酶的表达量进行优化,最终的酶量为855 U/L。使用镍柱将酶纯化,得到单一条带,相对分子质量约为55 k Da。分析其酶学性质,最适p H 7.0,在p H 5.0~7.0稳定;最适反应温度40℃,在50℃保温,其半衰期为6.9 min。以胆固醇为底物,在p H 7.5、37℃条件下测酶活,计算得动力学参数K_m为3.38 mmol/L,k_(cat)/K_m为6.09 s-1·(mmol/L)。