编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究

采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

利用PCR方法从黑曲霉（Aspergillus niger）基因组DNA中扩增内切菊粉酶（endo I）全长基因（1551 bp）,经序列分析后将其连接到表达载体p PIC9K上,得到重组表达载体p PIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115,阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明,重组酶的最适p H和最适温度分别为5和60℃,重组酶在55℃下保温9 h后,重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性,表现出极高的热稳定性,Cu²⁺、Ag⁺对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明,重组内切菊粉酶能在8 h内将4%（w/v）菊粉水解为3⁶个聚合度的低聚果糖,水解11 h后,低聚果糖得率达到63.5%,本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。      

基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性

为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

α-1,6-葡聚糖酶是专一作用于α-1,6糖苷键产生小分子葡聚糖的一类水解酶,广泛的运用于制糖工业和啤酒工业中。采用PCR法扩增朱黄青霉（Penicillium minioluteum）C12114的α-1,6-葡聚糖酶基因,将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9K。经SacI酶线性化电击转入毕赤酵母基因组,构建重组酵母GS115/pPIC9K-dex。对构建成功的转化子进行1.5%的甲醇诱导表达,在30℃条件下培养7d时酶活达到最大值,为88.35U/mL。      

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究

用麦麸、米糠农业废弃物作为主要原料生产木聚糖酶,对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的条件进行研究。结果表明,最适产酶条件:以质量浓度20%的麦麸作为碳源,4%酵母浸膏作为氮源,调节初始pH值5.5,培养温度30℃,摇瓶发酵装液量6%,培养时间130 h,在此条件下毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶最高活力达到2192 IU/mL。     

High-Efficient Expression and Pilot Scale Fermentation of Streptomyces Xylanase from a Constitutive Pichia pastoris Vector

To develop an efficient Streptomyces xylanase-expressing system necessary for large-scale industrial production, a DNA fragment encoding the endo-β-l,4-xylanase (XYL1) from Streptomyces sp. S38 was cloned into an expression vector pGAPZαA to generate a recombinant plasmid pGAPZαA-XYL1. The plasmid pGAPZαA-XYL1 was transformed into Pichia pastoris X-33. The secreted XYL1 protein was confirmed to be completely consistent to sequence as reported previously (GenBank accession number X98518.1). The secreted XYL1 protein was purified using the Q-Sepharose FF chromatography and Sephadex G-25 resin, with an estimated purity of greater than 90%. We also found that in a 50 L fermentor, the average level and enzymatic activity of secreted xylanases were up to 1.15 ± 0.09 mg/mL and 1528 ± 59 IU/mL, respectively. The pH and temperature for optimal XYL1 expression were 6.0 and 55°C, respectively. The Km and Vmax values of XYL1 were 2.0 mg/mL and 5000 μmol min^?1 mg^?1, respectively. In addition, the XYL1 was found to have good thermal stability and wide pH adaptability, suggesting that it may be a useful candidate for various commercial applications. The high-efficient expression and pilot scale fermentation of XYL1 in this study, together with enzymatic studies, provide a strong basis for future large-scale industrial production.     

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。      

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A（Mut⁺）和KM71/Xyn43A（Mut^s）。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。      

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

毕赤酵母工程菌产植酸酶补料分批发酵研究

对毕赤酵母工程菌PP-MS-NPm-4-16进行了补料分批发酵条件的研究,经摇瓶试验确定了发酵条件,即接种量为4%,生长阶段最适pH值为5.0,诱导阶段最适pH值为5.5,甲醇诱导浓度为30g/L,生长阶段添加豆油浓度为1.3%,诱导阶段豆油浓度为3%。在高密度发酵阶段,恒溶氧流加为最佳甘油补料方式,经过12h甘油补料,菌体密度OD600达145;甲醇诱导96h,酶活可达306.9kU/mL。     

Coprinopsis cinerea 漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

本文通过RT-PCR从Coprinopsis cinerea okayama7#130中克隆得到laccase1,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后设计不含信号肽序列的新引物扩增得到不含信号肽的漆酶基因1（lac1）,并构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1,电击转化毕赤酵母GS1115并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1全长为1593bp,编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-PAGE显示重组蛋白大小约为65KDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH为4.3。重组漆酶在45℃保存3h后活性基本保持不变,在pH4.0～10.0的范围内稳定性较好。成功分泌表达的漆酶活力达到1.108U/mL。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。