粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1在大肠杆菌中的分泌表达及其条件优化

克隆粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因pla A,与载体p ET-22b（+）连接构建重组质粒p ET-22b（+）-pla A,并将重组质粒导入受体菌E.coli BL21（DE3）中表达,构建得到重组菌AP22,IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析显示:重组蛋白以可溶性蛋白的形式大量存在于发酵液中,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。以磷脂酶A1酶活为指标,在单因素实验的基础之上,通过正交实验得到摇瓶培养最佳条件为:氨苄青霉素终浓度30μg/m L,IPTG加量0.25 mmol/L,温度为34℃,OD600值为0.3,诱导时间4 h。在此条件下重组胞外磷脂酶A1酶活可高达8.6 U/m L,比优化前提高了43.3%。      

磷脂酶A1及其在植物油脱胶中的研究进展

PLA1(Phosphatidylcholine 1-acyl-hydrolase,EC3.1.1.32)是专一水解天然磷脂Sn-1位酰基的酶,可以得到Sn-2酰基溶血磷脂.主要介绍了磷脂酶A1>脱胶原理、酶源分布,并对酶运用于脱胶方面的研究进展作一综述.     

磷脂酶A1水解卵磷脂的研究靠

研究磷脂酶A1水解卵磷脂的条件,确定最佳的酶解条件为酶解温度50℃,水∶磷脂(w/w)50,反应溶液pH 8.0,酶解时间9h,添加50μL 0.3mol/L Ca2 溶液及100μL磷脂酶A1溶液。     

辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响

为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1 (phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基因plaS进...     

磷脂酶A1催化水解大豆油研究

通过正交试验获得了磷脂酶A1催化水解大豆油的最佳水解条件:水解温度35℃、加酶量26U/g、加水量40%,水解时间8h.在此条件下,以KOH计,水解体系上层油层酸值达65.51 mg/g.当用O.1%的氯化钙水溶液作为水解反应物时,和蒸馏水相比,钙离子对维持磷脂酶A1多次循环利用的残余活力有促进作用.水解反应残余活力的磷脂酶A1再加上50%的新添加酶,表现出很强的催化水解活力,酶回收使用6次时,残余酶活力仍然有初次使用活力的86.88%.     

利用酶抑制剂固定化磷脂酶A1（PLA1）的研究

在固定化磷脂酶A1时,利用酶抑制剂与磷脂酶A1活性中心氨基酸残基结合,使戊二醛基与磷脂酶A1的非活性氨基残基缩合,从而起到保护酶活性中心基团,提高固定化酶活力作用。实验证明磷酸盐是磷脂酶A1的竞争性抑制剂,并求出Ki值。     

壳聚糖／海藻酸钠微胶囊固定化磷脂酶A1及其结构考察

对壳聚糖／海藻酸钠微胶囊固定化磷脂酶A1方法进行优化，利用红外光谱和电子扫描显微镜（SEM），对微胶囊结构进行考察。表明微胶囊具有规则的通孔结构，有很大的内表面积，可增加包埋酶的效率，提高磷脂酶与卵磷脂的接触界面面积和固定化酶的活力回收。     

均相壳聚糖固定化磷脂酶A1(PLA1)的研究

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂、酶液,三者均相反应,固定化磷脂酶A1,对它的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究。固定化最佳条件,以脱乙酰度为92.8%,平均分子量为7.84×105,戊二醛浓度为3%缩合后,在0.5mg/100mL酶、pH6.0、25mmol/L CaCl2、4℃条件下固定化酶,酶活力回收可达59%。固定化酶最适温度60℃、最适pH值8.0,Km=9.08mmol/L。     

固定化磷脂酶A1水解卵磷脂的研究

对固定化磷脂酶A1水解卵磷脂的条件进行优化，经正交试验确定最佳的酶解条件，即酶解温度为50℃，反应溶液pH为8．0，2％溶血磷脂4mL酶解时间10h，且酶解溶液中加入溶血磷脂对磷脂的水解影响最显著。     

黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白S对表达宿主菌大肠杆菌抑制作用机制

黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道.本实验通过对PlaS进行生物信息学分析并对其N端截短系列表达菌株的生长特性进行研究...     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

耻垢分枝杆菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大肠杆菌中的表达

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力[1-2].实验采用PCR的方法,克隆了来源于耻垢分枝杆菌的一段核苷酸序列,与已报道的海藻糖合成酶有60%以上同源性,推测该基因的编码产物具有海藻糖合成酶的活性,为进行其功能验证而在大肠杆菌中进行了表达.目的蛋白以可溶性蛋白为主,约占细胞可溶性总蛋白48%.为目前相关报道的最高值.经活性测定,表达的重组酶无需复性,能够催化麦芽糖生成海藻糖,在20℃反应20 h对麦芽糖的转化率可达61%,具有较高的应用价值.     

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：构建连接乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重组质粒。方法：以瑞士乳杆菌基因组DNA 为模板,克隆胞外蛋白水解酶基因,连接到以thyA 为选择压力的非抗性穿梭表达载体pW425et 上,构建重组质粒pW425et-R,转化入thyA 基因缺陷型E.coli X13 感受态细胞,SDS-PAGE 电泳检测显示该水解酶得到了表达。结果：成功构建了重组质粒pW425et-R,胞外蛋白水解酶基因在E.coli X13 中得到正确表达。结论：成功地表达了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因,可为进一步制备具降血压功能基因工程乳酸菌提供参考。     

Bacillus amyloliquefaciens中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质

淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens是一种嗜热细菌，其产生的中性植酸酶具有很好的应用前景．通过TD-PCR技术将Bacillus amyloliquefaciens编码的中性植酸酶基因克隆至原核表达栽体pET-30a( )上，在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达，表达量占大肠杆菌可溶性蛋白的33．5％．采用金属Ni^2 亲和层析对基因表达产物进行纯化，表达产物具有正常的生物学功能．     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质

目的:研究大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质.方法:首先采用PCR技术克隆编码大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因gadA,并将该基因克隆至载体pET-28a(+)中,形成重组质粒pET28a-gadA;然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA.进一步采用Ni...     

细菌透明质酸酶基因工程菌的构建及高效表达

目的将兽疫链球菌透明质酸酶hyl基因在大肠杆菌原核表达系统中高效分泌表达。方法通过PCR方法扩增得兽疫链球菌hyl基因,Xho I和Nco I双酶切后,连入表达载体pET26b(+),并转化入大肠杆菌,经低温异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖诱导表达,DNS法检测胞外透明质酸酶活性。结果成功构建含兽疫链球菌透明质酸酶基因hyl的大肠杆菌基因工程菌株,经IPTG诱导并添加甘氨酸后胞外透明质酸酶活性高达5.3×104 U/mL。结论实现了透明质酸酶在原核系统中的表达,为工业化生产奠定了基础,具有很好的市场前景。     

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。     

圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。