可视化跨越式滚环等温扩增技术在猪肉掺假检测中的应用

目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

跨越式滚环等温扩增可视化检测羊肉中鸭肉源成分

为可视化检测羊肉中鸭肉源成分,该研究将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术与荧光技术相结合,以生长激素(Growth hormone,GH)基因为靶基因分别设计并筛选羊、鸭特异性引物,拟建立可视化SRCA检测方法。对该方法进行特异性、灵敏度和检出限试验。结果显示：山羊和绵羊样品呈现绿色荧光,判定为阳性,13种非羊样品呈现橙黄色荧光,判定为阴性;鸭样品为阳性,14种非鸭样品均为阴性;表明该方法特异性良好。可视化SRCA分别检测羊、鸭DNA的灵敏度均为2.0×101 fg/μL。可视化SRCA检测羊肉中鸭肉源成分的检出限为0.001%(w/w)。对29份市售羊肉样品中鸭肉源成分的检测得知,可视化SRCA法检出率为17.24%,行标NY/T 3309—2018中方法检出率为10.34%。该方法经济、简便,结果肉眼可见,更适用于条件相对落后的实验室或资源相对匮乏的基层检测机构。     

核酸检测技术检测肉类种源研究进展

肉及肉制品是人类重要的食物来源, 为人体提供必要的营养素。但是以经济为目的的肉制品掺假, 是食品安全中屡禁不止的全球性问题。快速、准确、有效的检测技术是有效监督肉类掺假的关键。本文综述了核酸检测技术中热循环扩增技术(如普通PCR、实时PCR、多重PCR)和等温扩增技术[如环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)技术、交叉引物等温扩增(cross prime amplification, CPA)技术等]的原理及在肉类种源鉴别中的应用。提出梯型熔解温度等温扩增(ladder-shape melting temperature isothermal amplification, LMTIA)技术, 以期推进核酸检测技术的研究及在肉制品领域的应用。在肉类种源的检测中, 实时荧光定量PCR技术、跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification, SRCA)技术等均能检出0.01%的掺伪, 可用于定量检测, 表明这些核酸技术在肉类种源检测中有很好的应用前景。     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆

将跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)与荧光技术相结合,建立一种实时荧光SRCA技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法。对DNA提取方案进行评估,以大米的特异性基因(PDL、SPS、rbcL、GOS9)为靶序列设计引物,筛选适宜的引物,优化扩增反应条件结合荧光技术建立检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法,并对该方法进行评价。结果表明,建立的实时荧光SRCA方法检测大米DNA的灵敏度为8.45×101 fg/μL,经特异性评价证实其特异性良好,在人工模拟掺伪检测中建立掺伪比例的对数与Ct值的线性关系,线性方程为y=6.618x+7.651(R2=0.993),可准确检出蜂蜜中低至1%的大米糖浆成分。该方法灵敏度高,检出限低,能够快速、准确检测蜂蜜掺伪大米糖浆,为蜂蜜掺伪的快速检测提供了新思路。     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

该研究建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RFSRCA）技术快速检测志贺氏菌（Shigella）。该方法以志贺氏菌的ipaH基因设计引物,使用32株不同菌株对RF-SRCA方法的特异性进行分析,根据实时荧光曲线法对RF-SRCA方法的灵敏度和检出限进行判定,并使用该方法对60份食品样品进行检测。结果表明：13株志贺氏菌菌株呈阳性结果,19株非志贺氏菌菌株呈阴性结果,说明该方法特异性良好;RF-SRCA的灵敏度为5.97×100fg/μL,比普通SRCA方法高10倍;其在人工污染牛奶样品中的检出限为8.6×100CFU/mL,比普通SRCA方法检出限低10倍;60份食品样品中阳性样品数为2份,其检出率与SRCA方法一致,为3.33%。综上,RF-SRCA方法在检测志贺氏菌方面操作简单,特异性强,灵敏度高,能够实现快速检测。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70?种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明：所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×100?fg/μL,是传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法的1?000?倍,检出限为2.8×100?CFU/g,是传统PCR方法的1/1?000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB?4789.30—2016《食品微生物学检验?单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。     

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法。利用FTA膜快速提取模板DNA,根据沙门氏菌的inv A基因设计及筛选引物,建立FTA-SRCA反应体系。扩增反应在能够实现集约化检测的凹孔板中进行,反应结束后添加荧光染料观察结果。确定了该方法的特异性、灵敏度和人工污染样品的检出限,并对60个实际样品进行检测,评估其敏感性、特异性和符合率。结果表明:检测的17株沙门氏菌均为阳性结果,29株非沙门氏菌均为阴性结果,特异性良好。FTA-SRCA方法的灵敏度为6.81×100 CFU/m L,比PCR方法高100倍,比SRCA方法高10倍。对于人工污染的牛奶样品检测,FTA-SRCA方法的检出限为3.22×100CFU/m L,比PCR方法低1000倍,比SRCA方法低10倍。检测实际样品的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%,94.64%,95.00%。本研究建立的FTA-SRCA方法具有操作简便快速、成本低廉、特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,可用于食品中沙门氏菌的大批量集约化快速现场检测。     

可视化核酸试纸条法快速检测肉及肉制品中鸭源成分

建立肉及肉制品中鸭源成分快速检测的可视化核酸试纸条法。设计鸭特异性引物,建立鸭成分检测可视化核酸试纸条方法,验证方法的特异性与灵敏度,并对市售肉及肉制品进行检测。该方法检测灵敏度0.1%,能够从鸭肉样品扩增出291 bp特异性DNA片段,而鸡、鹌鹑、猪、马、牛、羊、驴、鹿、骆驼、胡萝卜、白菜等动植物样品无扩增条带。建立的鸭源成分检测可视化核酸试纸条法特异性好,灵敏度高,简便,快速,是鸭源成分检测的有效方法。     

环介导等温扩增与qPCR用于检测肉制品中狗源性成分的比较

目的 建立基于实时荧光PCR和环介导等温扩增检测肉制品中狗源性成分的检测方法并比较2种方法的检测效能。方法 针对狗线粒体CYTB基因保守序列, 采用Primer Explorer Version 4软件设计环介导等温扩增引物, Primer Express 3.0.1软件设计实时荧光PCR引物及探针。提取狗肉基因组DNA作为阳性模板, 黄牛肉等20种基因组DNA作为阴性对照, 分析扩增特异性; 用含靶序列的人工质粒确定检测灵敏度及人工掺肉样确定最低检出限; 用市售肉制品分析检出率。结果 对于肉制品中狗源性成分检测, 实时荧光PCR和环介导等温扩增检测均有较好的特异性, 人工质粒分析灵敏度分别为0.1、1 fg/μL。对10种市售狗肉制品的狗源性成分均检出阳性、10份不含狗肉制品均检出阴性, qPCR法和环介导等温扩增法的检测结果符合率均为100%。结论 qPCR法和环介导等温扩增法在检测肉及肉制品中的狗源性成分时, 在灵敏度、检出限和准确度上具有相当的效能。     

肉制品中猪肉源成分的Proofman-梯型熔解温度等温扩增检测

建立一种基于Proofman探针（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）的梯型熔解温度等温扩增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA）方法检测肉制品中的猪肉成分。选取猪细胞核中的特异性基因PRLR为靶基因,设计LMTIA引物和Proofman探针。通过优化反应体系,对所建立的方法进行特异性、灵敏度和最低检测限结果评价。结果表明：所建立的Proofman-LMTIA方法可在30 min内完成检测;相对于从鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、猫肉、狗肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉中提取的基因组DNA,可特异性检测猪基因组DNA;检测灵敏度为1 ng/μL,对人工模拟的混合肉样中猪肉的最低检测限为0.1%。所建立的Proofman-LMTIA方法对猪肉成分有较好的特异性,能够快速、准确检测出肉制品中的猪肉成分,可对猪肉掺假进行快速检测。     

膜芯片用于肉制品中动物源性成分检测的研究

目的研究膜芯片技术检测肉类及其制品中动物源性成分,验证该技术的准确性及可行性。方法利用膜芯片检测肉制品中的动物源性成分,对样品中猪、牦牛、驴及羊源性成分的灵敏度、检出限进行相关实验,并就实际样品的检测与国家标准进行比较。结果该技术用于动物源性成分检测特异性良好,4种动物源性检测的灵敏度为0.1 ng,检出限为0.1%(w:w),适用的样品种类较广,实际样品的检测结果与国家标准荧光PCR法一致。结论该技术可作为快速筛选的方法,为肉制品的动物源性成分鉴定和掺假检测提供理论依据。     

Saltatory rolling circle amplification for sensitive visual detection of Staphylococcus aureus in milk

Monitoring Staphylococcus aureus with high sensitivity is very important for ensuring milk quality and food safety. In this study, we used a rapid nucleic acid isothermal amplification method, saltatory rolling circle amplification (SRCA), for the detection of Staph. aureus in milk. The results of the SRCA method can be assessed visually by the presence of white precipitate or by fluorescence measurement. Thirteen Staph. aureus strains and 31 non-Staph. aureus strains were used to evaluate the specificity of SRCA. The method exhibited excellent detection of Staph. aureus genomic DNA at a concentration of 7.8 × 10¹ fg/µL when assessed by visible precipitate, and at 7.8 × 10⁰ fg/µL when detected by fluorescence after addition of the fluorochrome SYBR Green I. In artificially inoculated milk, the detection limits of SRCA were 5.6 × 10² cfu/mL by precipitate and 5.6 × 10¹ cfu/mL by fluorescence, respectively. Compared with conventional PCR approaches, the SRCA assay achieved at least 100-fold higher sensitivity. Moreover, the sensitivity, specificity, and accuracy of the SRCA-based system were calculated to be 100.00, 97.73, and 97.78%, respectively. These results indicate that SRCA has potential application as a sensitive and visual technique for the detection of Staph. aureus in milk.     

环介导等温扩增结合免疫层析试纸条快速检测羊肉及其制品中的鸭源成分

为实现肉及肉制品中掺假成分的快速检测,本文将环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)与免疫层析试纸条(immunochromatographic test strip,ICTS)相结合,建立了一套可在羊肉及其制品中特异并灵敏地检测出鸭源性成分的方法。根据鸭特异性细胞色素b(cytb)基因的6个特异性区域设计LAMP引物,其中两条内引物FIP和BIP分别使用生物素(biotin)和地高辛(digoxin)标记。使用LAMP扩增技术于65℃下扩增30 min产生生物素和地高辛标记的双链DNA产物,将扩增产生的双链DNA产物(10 μL)与90 μL上样缓冲液(PBS pH=7.4)混合均匀后使用免疫层析试纸条进行可视化检测。本研究所建立的LAMP-ICTS方法能够在40 min内特异性地检测出羊肉及其制品中的鸭源成分,且与其他肉类不存在交叉反应,检出限可达到0.01%(w/w)。市售实际样品检测结果显示,所采集的羊肉片、羊肉串样品中均有鸭源性成分,且此结果与行业标准方法(PCR-电泳)的检测结果一致。LAMP-ICTS方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、对仪器的依赖低等优点,适用于基层监管部门对羊肉及其制品真伪进行快速检测。     

利用LAMP技术快速检测羊肉制品中的鼠源性成分

为实现羊肉制品中鼠源性成分的定性检测,基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术,以鼠的线粒体基因（大鼠环氧化酶基因KP244683.1和小鼠的16S rRNA基因KY018919.1）为靶标,分别设计相应的LAMP特异性引物,通过优化反应条件,确定最佳LAMP反应体系。对混合模拟样品进行特异性、灵敏度和稳定性评估,应用LAMP和聚合酶链式反应检测方法分别对市售羊肉制品进行检测,对比分析检测结果。结果表明,本研究建立的LAMP方法特异性强,大鼠和小鼠的检出限分别为0.1%和0.5%,稳定性好,LAMP与聚合酶链式反应市售实际样本检测结果具有高度的一致性。因此,本实验建立的鼠源性成分LAMP检测方法操作简便、高效、准确,为鼠肉掺假快速诊断和基层诊断提供了新的选择,可作为羊肉制品中鼠源性成分的快速检测新方法。     

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R²=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R²=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他...     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

环介导等温扩增技术检测不同乳制品常见食源性致病菌

目的验证环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)试剂和仪器在不同乳制品常见食源性致病菌检测中的应用效果。方法针对不同乳制品中常见食源性致病菌,运用LAMP建立便捷、快速、高效地检测方法,并以实验室储备菌株及人工污染乳制品样品评价LAMP检测引物试剂和仪器在快速筛查中的适用性。结果选用的引物试剂仅对目标菌株核酸产生扩增,其余菌株无扩增,扩增检测灵敏度均达101fg/μL。用国家标准法和LAMP方法同时检测婴幼儿奶粉、奶酪样品,检测结果完全一致,对发酵奶样品进行检测时大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌也呈现出良好的检测结果。检测总耗时不超过30 min。结论采用的GenieⅡ实时荧光检测仪操作简单,便携轻便,可实时监测不同乳制品中的大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌污染,特异性强、敏感度高,适合企业批量现场快速检测。