可视化跨越式滚环等温扩增技术在猪肉掺假检测中的应用

目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。     

跨越式滚环等温扩增可视化检测羊肉中鸭肉源成分

为可视化检测羊肉中鸭肉源成分,该研究将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术与荧光技术相结合,以生长激素(Growth hormone,GH)基因为靶基因分别设计并筛选羊、鸭特异性引物,拟建立可视化SRCA检测方法。对该方法进行特异性、灵敏度和检出限试验。结果显示：山羊和绵羊样品呈现绿色荧光,判定为阳性,13种非羊样品呈现橙黄色荧光,判定为阴性;鸭样品为阳性,14种非鸭样品均为阴性;表明该方法特异性良好。可视化SRCA分别检测羊、鸭DNA的灵敏度均为2.0×101 fg/μL。可视化SRCA检测羊肉中鸭肉源成分的检出限为0.001%(w/w)。对29份市售羊肉样品中鸭肉源成分的检测得知,可视化SRCA法检出率为17.24%,行标NY/T 3309—2018中方法检出率为10.34%。该方法经济、简便,结果肉眼可见,更适用于条件相对落后的实验室或资源相对匮乏的基层检测机构。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70?种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明：所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×100?fg/μL,是传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法的1?000?倍,检出限为2.8×100?CFU/g,是传统PCR方法的1/1?000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB?4789.30—2016《食品微生物学检验?单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

该研究建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RFSRCA）技术快速检测志贺氏菌（Shigella）。该方法以志贺氏菌的ipaH基因设计引物,使用32株不同菌株对RF-SRCA方法的特异性进行分析,根据实时荧光曲线法对RF-SRCA方法的灵敏度和检出限进行判定,并使用该方法对60份食品样品进行检测。结果表明：13株志贺氏菌菌株呈阳性结果,19株非志贺氏菌菌株呈阴性结果,说明该方法特异性良好;RF-SRCA的灵敏度为5.97×100fg/μL,比普通SRCA方法高10倍;其在人工污染牛奶样品中的检出限为8.6×100CFU/mL,比普通SRCA方法检出限低10倍;60份食品样品中阳性样品数为2份,其检出率与SRCA方法一致,为3.33%。综上,RF-SRCA方法在检测志贺氏菌方面操作简单,特异性强,灵敏度高,能够实现快速检测。     

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆

将跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)与荧光技术相结合,建立一种实时荧光SRCA技术检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法。对DNA提取方案进行评估,以大米的特异性基因(PDL、SPS、rbcL、GOS9)为靶序列设计引物,筛选适宜的引物,优化扩增反应条件结合荧光技术建立检测蜂蜜掺伪大米糖浆的方法,并对该方法进行评价。结果表明,建立的实时荧光SRCA方法检测大米DNA的灵敏度为8.45×101 fg/μL,经特异性评价证实其特异性良好,在人工模拟掺伪检测中建立掺伪比例的对数与Ct值的线性关系,线性方程为y=6.618x+7.651(R2=0.993),可准确检出蜂蜜中低至1%的大米糖浆成分。该方法灵敏度高,检出限低,能够快速、准确检测蜂蜜掺伪大米糖浆,为蜂蜜掺伪的快速检测提供了新思路。     

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法.利用FTA膜快速提取...     

跨越式滚环扩增(SRCA)结合金纳米粒子可视化检测食品中的沙门氏菌

沙门氏菌是引起全球人类腹泻病的主要病因,严重危害人畜健康。传统检测方法耗时长,步骤繁琐,因此开展快速简便灵敏的可视化检测方法,具有重要意义。本文设计能与靶序列结合的探针,将其与金纳米粒子(AuNPs)结合。经跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)扩增的靶序列,高温变性后成为单链,其与金纳米粒子上的探针结合后,释放出金纳米粒子,在MgSO4的作用下,聚集呈现肉眼可见的蓝色,判定为阳性,阴性为紫色。依此,建立一种简便、快捷、灵敏的可视化检测方法。结果表明:该方法特异性良好,能够区分8株沙门氏菌阳性与8株非沙门氏菌阴性。可视化检测的灵敏度为5.5×100 CFU/mL。将牛奶样品人工污染沙门氏菌,检出限为3.7×100 CFU/mL。在50份实际样品检测中,与GB 4789.4-2016方法进行比较,该方法敏感性为100.00%,特异性为97.87%,符合率达到98.00%。本文建立的SRCA-AuNPs可视化检测方法,具有较高的应用价值,结果肉眼可见,适合于现场可视化检测和基层单位使用。     

滚环等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是影响人类食品安全的重要因素。人类食源性致病菌致病率的逐年上升,引起世界广泛关注。滚环等温扩增(rolling circle amplification, RCA)技术因具有高特异性、高灵敏度、稳定、操作简单等优点,在食源性致病菌检测中具有广泛的应用前景。近年来以滚环等温扩增技术为基础,针对食源性致病菌的检测新技术不断得到发展。本文概述了滚环等温扩增技术的基本原理、技术特点、在食品微生物快速检测方面的应用、存在的不足和解决措施,指明研究发展新方向,旨在为食源性致病菌在快速、高通量检测需求上增加新方法,对食品安全监管具有重要意义。     

跨越式滚环等温扩增技术结合CRISPR/Cas12a定量检测海产品中的副溶血性弧菌

将CRISPR/Cas12a系统与跨越式滚环等温扩增技术(saltatory rolling circle amplification,SRCA)相结合,建立一种快速、灵敏定量检测海产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的方法(SRCA-Cas12a)。通过SRCA扩增靶标DNA,CRISPR/Cas12a系统识别靶标DNA并裂解单链报告探针,从而建立SRCA-Cas12a检测方法。分析该方法的特异性与灵敏度,并进行加标回收实验和实际样品检测。结果显示该方法可区分副溶血性弧菌和其他食源性致病菌,特异性良好。在最优检测体系下,建立了副溶血性弧菌菌液浓度的对数与荧光信号强度的线性关系,线性方程为y=1.847 2x+2.473 8(R²=0.986 6),检出限为3.6 CFU/mL(R_SN=3)。在人工污染样品中副溶血性弧菌的加标回收率为95.5%～104.4%。在实际样品检测中,该方法的敏感性为100.0%、特异性为95.2%、符合率为97.2%。本研究所建立的SRCA-Cas12a方法具有特异性好、检测限低的优点...     

Saltatory rolling circle amplification for sensitive visual detection of Staphylococcus aureus in milk

Monitoring Staphylococcus aureus with high sensitivity is very important for ensuring milk quality and food safety. In this study, we used a rapid nucleic acid isothermal amplification method, saltatory rolling circle amplification (SRCA), for the detection of Staph. aureus in milk. The results of the SRCA method can be assessed visually by the presence of white precipitate or by fluorescence measurement. Thirteen Staph. aureus strains and 31 non-Staph. aureus strains were used to evaluate the specificity of SRCA. The method exhibited excellent detection of Staph. aureus genomic DNA at a concentration of 7.8 × 10¹ fg/µL when assessed by visible precipitate, and at 7.8 × 10⁰ fg/µL when detected by fluorescence after addition of the fluorochrome SYBR Green I. In artificially inoculated milk, the detection limits of SRCA were 5.6 × 10² cfu/mL by precipitate and 5.6 × 10¹ cfu/mL by fluorescence, respectively. Compared with conventional PCR approaches, the SRCA assay achieved at least 100-fold higher sensitivity. Moreover, the sensitivity, specificity, and accuracy of the SRCA-based system were calculated to be 100.00, 97.73, and 97.78%, respectively. These results indicate that SRCA has potential application as a sensitive and visual technique for the detection of Staph. aureus in milk.     

环介导等温扩增与qPCR用于检测肉制品中狗源性成分的比较

目的 建立基于实时荧光PCR和环介导等温扩增检测肉制品中狗源性成分的检测方法并比较2种方法的检测效能.方法 针对狗线粒体CYTB基因保守序列,采用Primer Explorer Version 4软件设计环介导等温扩增引物,Primer Express 3.0.1软件设计实时荧光PCR引物及探针.提取狗肉基因组DNA作...     

环介导等温扩增技术快速检测肉及肉制品中的牛源性成分

本文以牛源性线粒体细胞色素B(cyt B)基因为模板,采用软件Primer Explorer Version 4设计并筛选出LAMP特异性扩增引物,通过反应体系优化建立了肉及肉制品中牛源性成分的环介导等温扩增技术检测方法,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行了验证,同时采用国标方法和商品化检测试剂盒对市售的12种牛肉及牛肉制品进行对比检测。结果表明该检测方法具有高灵敏度、高特异性和高稳定性,适用于实际的生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。      

环介导等温扩增技术在食品安全检测中的应用

近年来食品安全问题频发, 国家和相关食品行业对食品安全问题变得越来越重视。为保证食品安全, 行之有效的检测方法必不可少。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种基因扩增技术, 自2000年发明以来广泛应用于医学、动物科学、食品学等领域, 现已成为食品检测技术中生物技术的重要组成部分, 由于其高灵敏度、高特异性、成本低、操作简单等优势而备受各国专家学者的青睐。本文对近年来LAMP检测技术在食品安全检测中的研究进展加以综述, 同时探讨LAMP技术在食品检测领域的研究现状以及未来的研究趋势, 为LAMP技术的发展方向提供参考。     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是一种新型的恒温核酸扩增技术。与传统的PCR技术相比, 该技术能在恒定温度65 ℃条件下, 利用4条特异性设计的引物, 2条内引物(forward inner primer, FIP)、(backward inner primer, BIP)和2条外引物F3 primer、B3 primer和一种具有链置换特性的Bst.DNA聚合酶。在30~60 min内对目的DNA序列进行快速、高效扩增, 其扩增产物为大量的双链DNA。通过对产物的处理, 结合双链DNA特点, 根据目标DNA的含量直接或者间接得到待测物含量, 从而达到一个较高的灵敏度检测。利用该技术实现了在多种领域, 包括食品致病菌检测, 食品微生物含量检测以及生物医学等的广泛应用。本文主要对LAMP的技术原理、产物检测方法、应用领域、与其它方法比较的优缺点以及发展现状进行相关的论述。     

滚环扩增技术在食品安全检测中的研究进展

食品安全一直受到广泛关注,在实现食品中污染物准确检出的前提下,快速方便的检测方式对食品安全的维持具有重要现实意义.滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)发展于20世纪90年代中期,是一种简单高效的体外核酸扩增技术,可在等温的条件下快速扩增出由模板互补序列串联而得的长单链DNA....     

肉类掺假检测技术研究进展

肉类是我国居民消费最大的食品之一,然而掺假事件时有发生,这不仅对消费者的经济利益造成损害,更有甚者会对人类身体健康造成影响,因此对肉类掺假进行检测鉴别显得十分重要。本文综述了各种肉类掺假检测技术的应用和特点,并探讨其发展趋势。目前,国内外最常用的检测方法有PCR检测技术、酶联免疫法(ELISA)、近红外光谱技术、色谱技术等。在这些技术中,以PCR为主的检测技术包括长度多态性PCR、随机扩增多态性PCR以及实时PCR等最为成熟,应用得也最为广泛。近红外光谱检测虽然检测速度比较快,但是准确度方面还有待改进。ELISA方法虽然已有商品化试剂盒出现,但由于受蛋白活性影响,其应用范围也受限。色谱分析方法近年来有了更深入的研究,随着高分辨质谱的出现,通过多肽鉴定肉类品种将是一个新的研究方向。随着科技的发展,多种技术相结合将会使掺假检测更加快速、可靠。     

A simple and sensitive aptasensor with rolling circle amplification for viable Cronobacter sakazakii detection in powdered infant formula

Cronobacter sakazakii is a foodborne, emerging opportunistic pathogen that causes severe bacteremia, necrotizing enterocolitis, and sepsis with a mortality rate of up to 80%. In this study, we developed a simple and sensitive fluorescent turn-off aptasensor with rolling circle amplification assay for viable C. sakazakii detection in powdered infant formula. The results showed that the proposed aptasensor has good performance and specificity for detecting viable C. sakazakii in pure culture and powdered infant formula samples within 3 h. Under the optimal reaction conditions, there is a linear relationship between fluorescent intensity at 490 nm and logarithmic concentration of C. sakazakii in the range of 2.7 × 10⁵ to 2.7 × 10² cfu/mL, with a limit of detection of 2.7 × 10² cfu/mL in pure culture. The proposed aptasensor achieved a recovery of 104 to 111% in pure culture, and 96 to 107% in spiked powdered infant formula samples. The proposed aptasensor does not require complicated DNA extraction steps or antibodies, and can be performed at 37°C, making it a convenient and sensitive strategy for C. sakazakii detection.