一种基于多重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法

为实现肉及肉制品掺假快速鉴别,分别以猪、牛线粒体DNA的COXⅠ,绵羊、山羊、狗、狐狸、貉线粒体DNA的16S rRNA及鸡、鸭线粒体DNA的12S rRNA基因为靶位点,设计扩增产物熔解温度(T_m值)具有显著性差异的特异性引物,建立一种用于快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的5重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析方法,通过特异性、灵敏度及市售样品的检测,对该方法进行检验和评价。结果表明:方法具有良好的特异性及灵敏度,单物种DNA检出限为0.001~1 ng,多物种混合DNA检出限均为0.1 ng,通过市售样品检测表明该方法可用于实际样品(包括生鲜样品和熟制样品)掺假的快速鉴别。     

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8 对特异性引物,构建出2 个三重和1 个二重实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明：该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3 个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度（melting temperature,Tm）范围分别为反应体系A：73.1～75.2、76.0～77.3、79.0～80.0 ℃,反应体系B：69.5～72.8、75.0～77.9、78.5～80.0 ℃,反应体系C：76.1～78.1、79.5～80.7 ℃;根据3 个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。     

多重real-time PCR技术快速鉴别特种乳中的乳源动物成分

建立一种特种乳中乳源动物成分快速鉴别多重实时聚合酶链式反应技术。通过筛选建立8?种不同乳源物种检测的多重实时聚合酶链式反应方法,在一个反应体系里可同时检测4?种乳源的特异性靶基因,绝对灵敏度达0.1～5?pg/μL,检出限可达0.1%。同时,建立了高效的DNA提取方法,样品裂解后可在12?min左右完成96?个样品的DNA提取,大大缩短了样品前处理时间。采用该方法对市售特色乳产品进行调查,结果显示标识不准确的产品比例达36.36%。     

4种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用

建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和Taq Man探针,以18S r RNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,并对该方法进行方法学验证,同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。当Ct值≤35.0时,方法对16种非目标源性具有良好特异性;灵敏度可检测到质量浓度为2×10^-4 ng/μL的模板DNA;对生肉的检出限为肉含量的0.001%,对熟肉制品的检出限为肉含量的0.01%;对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于肉及肉制品中常见掺假源性成分的检测。     

三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛和牦牛成分

为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3 种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法,同步检测上述3 种牛的成分。单重real-time PCR检测时,3 种牛的检测灵敏度均为0.025 ng/μL;双重real-time PCR检测时,两两组合的引物探针含量比例为1∶1时,黄牛的检测灵敏度降低至0.1 ng/μL,而水牛和牦牛仍为0.025 ng/μL;对三重real-time PCR检测体系进行优化,当黄牛、水牛和牦牛3 组引物探针的含量比例为3∶3∶2时,检测灵敏度最佳,黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL,而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL。但上述双重和三重real-time PCR检测的灵敏度,是建立在3 种牛的含量比例为1∶1∶1的情况下,若3 种牛的比例差异较大,特别是黄牛和牦牛的含量比例差异较大时,如比例为9∶1时,含量低的成分会存在漏检。因此,在对整块肉的样品进行检测时,可采用三重real-time PCR的方法同步检测3 种牛的成分;若样品可能为上述3 种肉的为混合物,如肉糜、肉松等,则建议采用单重real-time PCR检测。     

肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立

目的:建立一种能同时检测肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌的多重PCR检测方法。方法:根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵袭蛋白基因(invA)、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因(ipaH)和单核细胞增生性李斯特菌的内化素基因(inlA)设计引物,通过优化好的反应体系进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。结果:特异性实验结果表明4种菌均能在相应位置扩增出特异性条带。对污染4种菌的猪肉进行检测,确定出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检出限是102CFU/mL,志贺氏菌和单核增生李斯特菌的检出限是101CFU/mL。结论:本实验建立的多重PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏,适用于肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门菌和单核增生李斯特菌的快速检测。     

一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式,为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪,建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）的牛源性成分定量分析方法。通过对14 种动物的Beta-actin单拷贝基因序列进行分析,设计牛源性特异性引物、探针与动物源性成分通用引物、探针并建立双重ddPCR体系,推导出牛源性成分质量与其特异性扩增拷贝数之间的计算公式,对牛源性成分进行定量检测该方法得到牛源性成分质量M牛（mg）与其特异性扩增拷贝数浓度C牛（copies/μL）之间的计算公式为M牛=0.033C牛＋2.37,对已知牛肉质量的混合肉样品与不同部位的牛肉样品进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致。同时拷贝数相对含量可辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假。对市售样品的检测发现,存在目标肉样含量不达标以及不同程度的动物源性成分等掺假现象,说明该检测方法可为牛肉制品掺假量化判定和混合源性产品分级鉴定提供技术支撑。     

Real-time PCR和双向电泳联合鉴别婴幼儿配方羊乳粉的乳源成分

为实现对婴幼儿配方羊乳粉中乳源成分的准确判别,将基因检测作为初筛方法,以蛋白质双向电泳作为确证方法,研究该技术路线下对乳源成分检测的灵敏度、准确性等指标。优化建立的基于嗜热蛋白酶的一步式DNA提取法,仅需通过温控反应在17 min内完成DNA步骤,极大缩短了样品前处理时间;建立的快速实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）程序仅需28 min 26 s即可完成检测。通过牛（家牛、水牛、牦牛）、羊（山羊和绵羊）、山羊、绵羊单一乳源成分,以及哺乳动物内参照检测体系,可以实现对低至10～100 pg/μL DNA的检测,对混合样品中牛源性成分检测的灵敏度可达1%（m/m）。然后结合双向电泳技术进一步确证产品的蛋白成分来源,可以判定牛基因检测阳性的样品是否含有来源于牛乳酪蛋白或乳清蛋白,进而对样品的真实性进行判定。real-time PCR法和双向电泳技术联合检测解决了以往婴幼儿配方乳粉检测中因配料复杂乳源判别困难的瓶颈问题。     

高分辨熔解曲线技术结合荧光实时PCR法同时检测鸡肉中4种食源性致病菌

建立高分辨熔解曲线技术同时快速检测鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌.本研究分别以上述4种菌的fimY、hly、nuc和orfC特异性基因为靶基因,建立能同时检测多种食源性致病菌的多重HRM-real time PCR检测体系,并对反应的特异性、灵敏度、重复性以及在人工染菌样品进行了评价.所建立的...     

肉制品中植源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法的建立

为改善产品品质,肉制品加工过程中常常添加植物源性成分,当前转基因农作物的商品化及其在市场上 的广泛流通导致肉制品中被带入植源性转基因成分的风险增加。以转基因植物中常涉及的调控元件CaMV 35S启 动子、NOS终止子以及标记基因NPTⅡ为检测目标,设计相应的引物和Taq man探针,利用载体pRⅠ 101-AN DNA 为模板,通过优化反应体系和反应参数,建立肉制品中植源性转基因成分的单重和多重荧光定量聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction,PCR）检测方法。通过比较分析,考察多重荧光定量PCR检测方法的灵敏性、重复性和准 确性,结果表明,多重荧光定量PCR检测方法灵敏度高、重复性好且与单重体系的检测结果具有很好的一致性。     

基于实时荧光聚合酶链式反应技术定量检测肉制品中动物源性成分研究进展

实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）技术灵敏度高、特异性强,广泛用于肉制品中动物源性成分的定性、定量分析。已有多种基于RT-PCR技术的分析策略用于实现肉制品中动物源性成分的定量检测,已报道的定量分析策略各有优势及缺陷,目前尚无可推广的国家标准方法发布。本文针对采用RT-PCR技术对肉制品中动物源性成分定量检测的分析策略及其中的关键因素（结果表示形式、靶基因、DNA提取效率、DNA降解、扩增效率、标准物质、物种基因组大小）进行综述分析,为建立最优定量分析模型提供思路,期望找到操作简便、成本较低、可推广实施的定量分析策略,实现对肉制品中动物源性成分进行准确定量检测,促进国家标准检测方法的制定。     

聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

目的：建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法：以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ ）基因序列为靶位点设计引物,进行聚合酶链式反应扩增,建立鸭源性成分检测方法;以常见畜禽肉,包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测;以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液,对鸭肉DNA进行梯度稀释,检测灵敏度。结果：该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高（0.1 μg/kg）,且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响,可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。     

RT-PCR结合高分辨率熔解曲线对两种致病菌的快速检测

为建立食品中金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的双重快速检测方法。用缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)对两种目标菌进行增菌培养,采用直接提取法提取样本DNA,比较实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)中的退火温度,调整高分辨率熔解曲线(high-resolution melting curve,HRM)分析条件,建立同时检测金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的方法。结果表明,PCR扩增最佳退火温度为58℃,两种目标菌的Tm值分别为金黄色葡萄球菌77.05℃,单核增生李斯特氏菌79.39℃;试验灵敏度分别可以达到102、103 CFU/g。     

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

以鸡转化生长因子β-3(transforming growth factor beta-3,TGFB3)基因、猪朊蛋白(prion protein,PRNP)基因和鸭、牛生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,设计合成特异性引物和TaqMan探针,通过对实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系和反应条件的优化,建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:本研究所建立的方法只在鸡、鸭、猪或牛源性成分存在时才产生特异性扩增曲线,表明该方法具有良好的特异性;且对鸡、鸭、猪和牛源性成分的最低检测质量浓度分别可达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL,具有良好的灵敏性;应用建立的检测方法对市售34份速冻食品鸡、鸭、猪和牛源性成分进行同时检测,能够实现对速冻食品中4种动物源性成分的有效检测,进一步分析发现,15份速冻食品源性成分测定结果与外包装标注成分不一致。本研究所建立的同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,且操作简单、适用范围广,能够满足日常检测需求。     

三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因

针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×102 拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA（gDNA）为模板相当（ΔCt＜1）。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。     

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针...     

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明：使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。