实时荧光PCR法鉴别莜面中掺杂淀粉的植物源性

以红薯ACtin基因、马铃薯UGPase基因、玉米ZEIN基因、木薯g3pdh基因设计种属特异性引物探针,以莜麦Avenin基因、真核生物18S rRNA为对照,建立一种实时荧光PCR法对莜面掺杂植物源性淀粉进行鉴别。该方法特异性强,相对灵敏度为0.1%,可用于莜面中掺杂植物源性淀粉的鉴别。     

实时荧光定量PCR法鉴别生鲜羊乳中牛源性成分北大核心CSCD

建立了生鲜羊乳中牛源性成分的荧光定量PCR检测法。结合了多物种识别的通用性引物和单一特定物种识别的特异性引物,通过荧光定量PCR的方法进行扩增,收集荧光信号,达到鉴别生鲜羊乳中牛源性成分的目的。该方法具有快速、简便、灵敏和特异性强的特点。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...     

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的 基于分子生物学技术,研究建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法 该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果 该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率80.95%,与参比方法检测结果一致。结论 建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。     

实时荧光PCR法检测肉制品中猪源性成分

目的S建立一个高特异性和高灵敏度的有效检测猪源性成分的检测方法。方法S以猪雌激素受体基因设计合成一对特异性引物,采用液氮研磨结合试剂盒抽提的方法提取猪肉中的DNA,分别以300S,30S,3S,0.3S和0.03Sng为模板量进行梯度反应,基于荧光定量PCR技术(SYBR法)建立检测方法。结果S以Ct值作为纵坐标,以lgXS(X为DNA的量,ng)的值作为横坐标,得到标准曲线方法Ct=30.473-3.542lgX,SR2=0.9997;该方法的检测灵敏度达到2 Spg。结论S该猪源性成分检测方法简单快捷,特异性和重复性好,灵敏度高,可作为市场监督和检测鉴定的可行性方法。     

中药材浙贝母的实时荧光定量PCR方法研究

目的:探讨荧光定量PCR对浙贝母鉴别的可行性。方法:采用实时荧光定量PCR法从试样中提取DNA,进行引物扩增,并通过Cq值和扩增曲线对样品进行判断。结果:4批浙贝母的Cq值均低于30,曲线有明显的指数增长期;平贝母、川贝母和土贝母则无Cq值,曲线为一直线。结论:本方法用于鉴别浙贝母操作简单,准确率高,重现性好,可行有效。     

利用实时荧光定量PCR法检测食品中鹌鹑源性成分

为建立基于TaqMan实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在食品中的鹌鹑源性成分的定量检测方法,根据现行检验检疫标准(SN/T 2727-2010)合成引物及探针。首先对13种不同动物鲜肉组织的DNA进行鹌鹑源性成分特异性检测,然后对鹌鹑源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工制品中检测方法的适用性。研究结果表明:建立的方法特异性强,除鹌鹑肉外,牛、羊、猪、马、驴、狗、兔子、鸡、鸭、鸽子、火鸡、鱼12种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,鹌鹑组分DNA的检出限可达10 fg/mL,灵敏度可达0.001%;方法的适用性较广,可以用于加工制品中鹌鹑源性成分的检测。     

实时荧光PCR检测鸭血制品中掺假成分

试验对28个样品分别进行鹅、鸡、鸭、猪源性荧光PCR扩增反应,结果表明市售的鸭血制品中均有鸭成分,未发现直接以别的动物血制品冒充鸭血产品的情况,但在鸭血制品中掺入别的动物血液的情况较为普遍.28个样品中只检出鸭成分的样品有9个,同时检出3种动物源性成分的样品有1个,其余样品均检出2种动物源性成分.在掺假的鸭血制品中,掺...     

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度。结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分。     

实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用

随着转基因技术在谷物育种中的广泛应用,以及转基因粮油及其制品消费的不断增加,加强粮油转基因成分的检测技术的研究极为必要.阐述了实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用,主要从实时荧光定量PCR技术,实验室条件,实验步骤以及应用范围等方面进行了阐述.     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

不同酸奶微生物的实时荧光定量PCR比较研究

采用实时荧光定量PCR技术对不同酸奶中乳酸菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和大肠菌群等主要微生物进行了比较研究。结果表明,不同酸奶中乳酸菌总数和大肠菌群均显著高于国家标准。不同酸奶中乳酸菌总数差异显著,1号酸奶比2号高63%,而3号又是1号的2.45倍。1号酸奶的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌明显高于2号或3号,而2号和3号却差异不明显。     

基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量

该研究将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,r PCR)与微滴式数字PCR技术(micro-droplet digital PCR,dd PCR)相结合,利用dd PCR建立拷贝数和羊肉质量的函数关系,确立了基于r PCR定量检测羊肉含量的方法。特异性实验结果表明,除绵羊和山羊外,非目标物种DNA未出现特异性扩增;灵敏度实验结果表明,该方法的最低检出限为0. 01 ng/μL;通过对已知成分的混合样品和市售样品的检测表明,该方法能够对含量在5%以上的羊肉进行准确定量。因此,该方法在肉制品中羊肉含量检测和掺假鉴别方面具有较好应用潜力。     

常见肉类中鸭源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的通过筛选引物、探针体系,优化PCR反应条件,建立常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法。方法针对线粒体基因设计50对引物探针,以鸭DNA为模板,利用PCR和荧光PCR方法筛选引物探针并确定反应条件,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,最终确定荧光定量PCR方法的引物、探针及反应条件。结果当样本含量为0.1%时,本方法仍可特异、灵敏地检出鸭肉成分,检测Ct值可稳定在20以下。结论建立了常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法,可用于肉类制品中鸭源性成分的鉴定。     

鲟鱼皮胶原蛋白的理化特性研究

本文以俄罗斯鲟鱼皮为原料,采用酸法和酶法提取胶原蛋白,研究了酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶促溶性胶原蛋白(PSC)的蛋白类型、结构、热变性温度和溶解度等理化性质,并与牛跟腱I型胶原蛋白(BATC)进行比较。SDS-PAGE电泳图显示ASC和PSC均包含了两条α链(α1链和α2链),为I型胶原蛋白;傅立叶红外光谱图表明提取的2种胶原蛋白均保存了完整的三螺旋结构,但ASC的有序度相对较高;ASC和PSC的热变性温度分别为32.48℃和32.68℃,低于BATC;在酸性pH条件下(pH 1~4),ASC和PSC溶解度较高,当Na Cl浓度大于2%时,PSC的溶解度较高;扫描电镜显示2种胶原蛋白均为网状结构,ASC的孔径较均匀,且孔径较小。上述结果表明提取方法不同,导致2种胶原蛋白的理化性质具有一定的差异,但都具有较好的热稳定性、溶解性,能形成较好的网状结构,有潜力的作为胶原蛋白的替代来源。     

实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术

将5种致泻大肠埃希氏菌的毒力基因保守序列进行设计并合成了引物和探针,建立的多重实时荧光PCR4种试剂盒可以同时检测5种致泻大肠埃希氏菌。结果表明:4种试剂盒的12对毒力基因通过5种致泻大肠埃希氏菌的标准储备菌株均得到验证;并且12对毒力基因只对对应的致泻大肠埃希氏菌特异性起作用,对常见的食源性致病菌都无扩增曲线;escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的检出限是10CFU/mL,aggR基因的检出限是10~2 CFU/mL,astA和pic基因的检出限是10~3 CFU/mL,而stx_2A、ipaH和stIb基因菌液浓度10CFU/mL时,均可观察到明显的"S"型扩增曲线,且线形较好;并且对抽查和委托检验的肉类、奶和动物腹泻物以及人工污染样品等40份样品进行检测,共检出11份阳性样本,与GB 4789.6—2016标准检测结果相一致,表明建立的4种试剂盒方法具有良好的实用性。     

恩诺沙星及其代谢物在俄罗斯鲟多组织中的 代谢及消除研究

目的研究恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在俄罗斯鲟中的代谢及消除规律,制定恩诺沙星在俄罗斯鲟体内的休药期。方法在水温12～15℃条件下,以60 mg/(kg?bw)剂量对体重为(750±50) g的健康俄罗斯鲟灌服恩诺沙星,灌服后的0～3360 h内不间断采样,使用高效液相色谱-串联质谱仪测定各组织内恩诺沙星及其代谢产物含量。结果灌药后,恩诺沙星在俄罗斯鲟鳃、血浆、肌肉、肝脏、肾脏、皮肤中达峰时间Tmax分别为0.25、9、12、12、18、24 h;肾脏、肝脏、皮肤、肌肉、鳃、血浆达峰浓度Cmax分别为31.863、23.435、21.434、18.640、10.342、2.599 mg/kg;消除半衰期以皮肤最大t1/2为394.431 h、血浆最小为129.6 h。鳃中药物浓度有2个峰值,第1次达峰时,血浆中药物浓度远低于鳃,推测与受试鱼进食习惯或组织结构有关。代谢产物环丙沙星代谢及消除趋势与恩诺沙星大致相同,血浆最早达峰, Tmax为12 h,达峰浓度以肝脏和肾脏较高,Cmax分别为6.876mg/kg和5.648mg/kg。结论从水产品质量安全角度应用本研究结果:以皮肤和肌肉作为可食性组织,恩诺沙星和环丙沙星残留总量不超过0.1 mg/kg至少需要100 d。     

实时荧光定量PCR法鉴定发酵乳中嗜热链球菌

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,根据目的基因设计特异性引物和探针,建立一种能够快速准确鉴定发酵乳中嗜热链球菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)法,通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对所建立方法进行验证,并使用该方法对市售的60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品进行检测。结果表明,rec A基因具有种间特异性,种间差异率>10%,以其为目的基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测嗜热链球菌;绝对灵敏度达1 pg/μL,相对灵敏度达10³CFU/m L;在培养物水平和基因组水平抗干扰能力良好。采用该方法从60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品中均能检测出嗜热链球菌,说明实时荧光定量PCR方法能够快速、准确的对发酵乳中嗜热链球菌进行检测。     

实时荧光定量PCR在食品致病菌及转基因成分检测中应用

与传统定性PCR技术相比,实时荧光定量PCR有更多的优点,其速度快,特异性更强、灵敏度更高、无污染性、自动化水平高等,且能对DNA模板进行定量。本文综述了实时荧光定量PCR技术原理、分类及其应用,并对其存在的问题和发展前景进行了展望。