ChBD和SUMO双功能融合肝素酶Ⅰ的设计与表达

利用ChBD和SUMO标签构建4种不同的融合蛋白体系,分别为ChBD-Hep I、ChBD-SUMO-Hep I、SUMO-ChBD-Hep I和ChBD-Hep I-SUMO。经过发酵工艺优化实验,确定该4种酶在最优条件下的摇瓶发酵酶活分别为2.44IU/mL、6.92IU/mL、6.01IU/mL和4.51IU/mL。同时,通过酶学性质研究,确定该4种重组酶的最适反应温度与pH分别为30℃和7.0,表明SUMO和ChBD标签不影响Hep I的催化反应。4种重组酶的热稳定性较天然Hep I明显提高,其中ChBD-SUMO-Hep I在30℃半衰期达50min,由此,确定其为最优菌株。将ChBD-SUMO-Hep I进行5L发酵罐扩大培养,酶活达到26IU/mL,是摇瓶培养的5倍,表明其具有工业化生产的潜质。     

金龟子绿僵菌深层培养产几丁质酶的研究

金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一种重要的昆虫寄生真菌,从自然罹病死亡的金龟子体内分离到一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)M-6。研究了该菌深层培养产几丁质酶的情况,几丁质酶合成的最佳碳源和诱导物为几丁质,在以0.5%(w/v)几丁质为碳源时,其产几丁质酶活达0.126IU?mL?1,在一定范围内增加培养基中几丁质浓度,葡萄糖浓度,微量元素盐浓度和碳氮比都能提高几丁质酶活。胆汁酸和吐温80作为表面活性剂能显著提高几丁质酶活。通过摇瓶试验得到优化培养基和培养条件。根据优化条件在摇瓶和3.7L发酵罐中分别进行产酶试验,实验结果表明,几丁质酶活分别达到0.231IU?mL?1和0.273IU?mL?1。最适反应温度为55℃,最适反应pH6.0,在45℃,pH3.0~9.5较为稳定。Zn2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+离子对几丁质酶活性有明显的促进作用,而Hg2+、Co2+和Fe2+离子完全抑制几丁质酶的活性。     

毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化

对毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶的培养条件进行优化。单因素实验结果表明,该菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮,最佳氮源为酵母膏;通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养条件为30℃、接1种量10％、初始pH5．5、初始甲醇含量1．0％;甲醇最佳诱导时间为18h,经优化后,木聚糖酶酶活达到1765IU·ml^-1。该酶耐热温度为70℃。     

选择性降解木质素白腐菌筛选的研究

对国内外15种产漆酶的白腐菌进行初步筛选,从中获得7株产漆酶活性较高的菌株。经对木材降解能力的分析及在培养过程中所产各种酶酶活的测定,得到了2株产漆酶酶活高、降解木质素选择性优良的菌株,其中Flammulinavelutipes和My-1两菌株经14天液体培养,漆酶酶活高达214IU/mL和231IU/mL。杨木经其处理30天后木质素降解率达到22.67%和15.46%。     

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵条件的研究

通过单因素及正交实验对现存黑曲霉菌株产酶发酵条件进行了研究,结果表明:当培养基为:玉米芯4.0%;酵母粉1.0%;KH2PO40.4%;MgSO40.08%;(NH4)2SO40.4%;培养温度30℃,摇床转速220r/min,接种量6.0%,装液量40mL/250mL,初始pH值5.0,发酵周期168h;此条件下β-葡萄糖苷酶酶活达56.96IU/mL。     

产GL-7ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达

实现了戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶的组成型表达,并通过替换重组质粒启动子的RBS序列,在摇瓶培养条件下,使新构建的重组质粒pGEMKT-HPRfACY在大肠杆菌JM105中表达GL-7ACA酰化酶酶活达到0.44 U/mL,是替换前的2倍. 使用廉价的玉米浆作为培养基中氮源主要来源,使JM105/pGEMKT-HPRfACY菌株酶活提高到2.98 U/mL. 采用补料批式培养,利用流加营养物控制发酵中后期的pH值,在pH为7.5的条件下,酶活峰值达到6.37 U/mL. 该体系无需诱导,工艺操作过程简单,成本低廉.     

以里氏木霉制备纤维素酶的研究

以里氏木酶（Trichoderma reesei Rut C-30)为产酶菌株,采用不同纤维底物（麸皮,玉米皮及玉米秸杆）制备纤维素酶,研究其酶解效果及酶系构成。研究表明,玉米秸杆底物最佳,滤纸酶活达到1．87IU/mL,产酶收获期为112h,麸皮底的收获期最短,达48h但滤纸酶活最低,达0．76IU/mL,产酶时间长短将影响酶系构成,时间长酶系结构合理,滤纸酶活高。     

产碱性脂肪酶菌株的筛选和培养

以Rodamine B平板筛选法获得了一株高活力碱性脂肪酶产生菌Pseudomonas sp. ZJU-02.摇瓶产酶实验表明，适宜产酶培养基为(%)：玉米浆3，植物油1, K2HPO4 0.1, KCl 0.05, MgSO4 0.05, Tween80 0.05；最佳培养条件为温度26℃、初始pH 6.5. 脂肪酶活力可高达86 IU/ml. 该酶在70℃以下、pH 7.0~10.5范围内稳定；酶反应的适宜温度为40℃，适宜pH为9.5. 该酶制剂在洗涤剂和制革工业中有良好的应用前景.     

一株聚乙烯醇降解酶产生菌的产酶条件优化

枯草芽胞杆菌WSH-062在摇瓶培养中能产生胞外的PVA降解酶。通过单因素及正交实验对其进行了发酵条件的优化。研究结果表明:该菌产生的PVA降解酶为诱导型酶;2 g/L的复合氮源(NaNO3和酵母粉的配比为1∶1)就能满足细胞生长和产酶的营养需要。正交实验分析得到最优的发酵培养基为:PVA 30 g/L,酵母粉12.2 g/L,NaNO3 10.1 g/L,MgSO4.7H2O 0.35 g/L,KH2PO4 3 g/L,pH值7.2。优化之后的PVA降解酶酶活达到5.00 U/mL,比优化前提高了4.75倍,并且重复性较好。     

白腐菌Coriolus versicolor的培养及产漆酶条件的研究

从液体和固体两种培养体系出发,探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系中,白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是缓冲体系起始pH值为5.8、摇瓶转速为180r/min、装液量为100mL/500mL;在所有测试的碳源中,葡萄糖为最佳碳源,在二糖中以蔗糖为碳源,漆酶酶活相对较高,而多糖(如淀粉)不利于漆酶的生成。在所有测试的氮源中,硝酸铵和酒石酸铵组合为最佳氮源,氯化铵和尿素的效果次之,蛋白胨的效果最差。当碳源与氮源质量比(C/N)大于10∶1,即高碳低氮的培养条件有利于漆酶的生成。芳香化合物诱导剂ABTS浓度为0.5～1mmol/L时,对产漆酶的影响最明显,与限氮培养基中产酶相比可提高酶活5倍,约为230IU/mL;0.5mmol/L愈创木酚、1mmol/L阿魏酸和0.05mmol/L二甲基苯胺的添加可提高酶活约2～2.5倍;0.01mmol/L黎芦醇的添加可提高漆酶酶活约1.6倍。由于酪氨酸具有酚类化合物的特点,也可作为一种无毒的天然漆酶诱导剂。菌株漆酶活力在固体培养体系明显低于在液体培养体系。     

黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

普鲁兰酶产生菌的筛选鉴定及其发酵条件优化与酶学性质研究

从淀粉厂附近土壤中筛选得到5株产普鲁兰酶的菌株,与实验室已有保藏菌株做活性对比,结果筛选得到的S1117产酶活性较高,根据其形态特征及16S rRNA序列分析,初步鉴定为芽孢杆菌。对其产酶条件进行了优化,确定了该菌株的最适发酵培养条件,其发酵54 h时酶活达到最大2.5 U/mL。初步研究了其酶学性质,其所产普鲁兰酶反应最适温度与pH分别为40℃,5.2;在60℃仍保持有80%以上酶活。     

过氧化氢-乙酸联合预处理对甘蔗渣酶解和发酵的影响

采用过氧化氢-乙酸(HPAC)对甘蔗渣(SCB)进行了联合预处理。以预处理后的甘蔗渣为原料,先进行酶水解,然后将水解液进行乙醇发酵,探讨预处理对甘蔗渣酶解和发酵的影响。实验结果表明：20 g甘蔗渣,加入150 mL过氧化氢水溶液(75 mL过氧化氢(30%)和75 mL水)和150 mL乙酸(99%),硫酸用量为过氧化氢-乙酸溶液体积的0.5%,在70℃反应2 h时,HPAC预处理脱除了88.85%的木质素,并使90.10%的纤维素保留在底物中。底物(HPAC/70-SCB-0.5)的酶可及度是80.30 mg/g,与相同条件下单独过氧化氢预处理(HP/70-SCB)和单独乙酸预处理(AC/70-SCB)相比,分别增加了38.26%和31.08%,甘蔗渣木质素的表面覆盖率从原料的0.66降低至0.22。酶解上清液在酶用量为5 FPIU/g(以底物计)条件下水解后,葡萄糖得率是87.63%,分别是HP/70-SCB和AC/70-SCB的6.89和20.62倍,发酵产乙醇质量浓度是7.57 g/L,分别是HP/70-SCB和AC/70-SCB的7.65和22.94倍。     

毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

香菇多糖酶催化酯化技术及其抗病毒活性研究

以干香菇多糖为原料,在中性脂肪酶催化下,进行香菇多糖和丙酸的酯化反应研究。通过单因素试验得出最优酯化反应条件为:反应时间30 min、加酶量0.05 g、丙酸用量2 mL、多糖用量0.1 g和反应温度35℃,在此优化的条件下,酯化度为12.26,红外光谱证实有酯键生成。该酯化多糖对Hep G2215 细胞分泌的HBeAg 有不同程度的抑制作用,其治疗指数TI大于2。     

NaOH/AQ预处理对玉米秸秆脱木质素及酶解性能的影响

对玉米秸秆进行氢氧化钠/蒽醌（NaOH/AQ）去木质化预处理,考察了预处理温度、时间和NaOH用量对玉米秸秆脱木质素程度的影响,并探讨了脱木质素程度对提高预处理后物料酶解性能的影响。L₉（3⁴）正交试验得出较适宜预处理工艺条件为：温度160℃,时间60 min,NaOH用量（以绝干原料质量计）2.8%;其他条件为AQ用量0.05%,固液比1：5（g：mL）,此时木质素脱除率为75%,酶解后聚糖转化率达到73.79%。随着物料脱木质素程度的提高,其酶解效率相应增加;当木质素脱除率达到一定程度后,预处理后的聚糖转化率达到最大值,继续提高木质素脱除率,聚糖转化率反而降低。响应面优化的酶水解工艺条件为纤维素酶用量30 FPU/g,β-葡萄糖苷酶10 IU/g,反应时间72 h,温度50℃,底物质量分数2.5%,此时还原糖得率为85.62%。对酶解液进行HPLC分析,酶解液中的葡萄糖质量浓度为14.83 g/L,木糖质量浓度为4.83 g/L。XRD分析显示,预处理前后纤维素的晶型没有变化,而结晶度由31.40%提高至46.91%,表明物料中木质素和半纤维素发生了不同程度的溶出。     

水稻秸秆渗滤床半固态厌氧发酵性能研究

以水稻秸秆为原料,利用自行设计的渗滤床反应器,对比研究了不同温度（20、25、30和35℃）及不同预处理方式（NaOH、生物试剂和沼液）对秸秆厌氧发酵产气性能、物能转化率、发酵后沼液性能和产气成本等方面的影响。实验结果表明：发酵后总固体（TS）质量分数稳定在13%~15%之间,属于半固态厌氧发酵,同时累积产气量与温度、发酵后COD及NH₃-N的变化量均呈极显著正相关。相同温度（20~30℃）条件下,经预处理后的水稻秸秆TS产气率较空白均有所提高;其中沼液预处理效果最为明显,35℃条件下,TS产气率及挥发性固体（VS）产甲烷率分别为154.0和55.2 mL/g,较空白样品分别提高25.1%和52.5%。同时,沼液预处理可显著提升厌氧发酵产气中的甲烷体积分数。各预处理样品TS产甲烷率及VS产甲烷率呈随温度（20~30℃）上升而增加的趋势,但产甲烷提升率随温度的上升而逐渐下降,将系统温度从20℃提升至25℃,各处理产甲烷率可提高90%以上。考虑到沼气工程罐体增温及产能收支平衡等因素,温度控制在25℃是经济性最好的策略模式。从产气成本上分析,自产沼液具有较佳的处理效果和较低的生产成本,每生产1 m³沼气的可变成本1.62元。     

真菌细胞溶壁酶的分离纯化及其酶学性质研究

采用长梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum Rifai)958-11菌株,经过发酵,分离提纯出一种真菌细胞溶壁酶,并对其进行酶学性质研究。长梗木霉培养,利用:(NH4)2SO4沉淀,sartobind S离子交换层析和Sephacryl S-200柱层析对该发酵液进行分离纯化,用担子菌做为酶反应的底物研究该酶的酶学性质。经发酵获得的酶液,可在最佳反应条件下,1～2h内产出原生质体105～106个/毫升酶液。酶反应最适温度为30℃,最适pH为5.4,可以在0.6mol/L的氯化钾或0.6mol/L的硫酸镁为等渗液的条件下,溶解部分担子菌的细胞壁,得到高活力的原生质体。     

谷氨酸脱羧酶工程菌的发酵工艺及酶学性质

对谷氨酸脱羧酶(GAD)工程菌DM201的发酵及转化条件进行优化,分析了发酵过程中异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导条件、转化体系pH、底物浓度和金属离子等因素对谷氨酸脱羧酶活力的影响。发酵过程中最佳IPTG诱导条件为:浓度0.4mmol/L、时间5h、温度30℃;转化温度45℃,pH=4.0,ρ(L-谷氨酸)≈110g/L,镁离子在50mmol/L和5mmol/L浓度时对谷氨酸脱羧酶酶活有稳定作用,铜锌离子对其酶活的抑制作用显著。     

一株耐NMMO纤维素酶菌株的筛选及发酵优化

在常规筛选方法的基础上,利用在富集培养基中加入10 g/L NMMO,从土壤中筛选获得一株耐NMMO的高活性纤维素酶菌株Galactomyces sp. CCZU11-1。经研究,最适产酶培养条件为：碳源为甘蔗渣（5 g/L）,氮源为(NH4)2SO4（5 g/L）,表面活性剂为Tween-80（8 g/L）,培养温度为30 ℃,初始培养pH值为5.5。在此条件下菌株培养7天后,FPA及CMCase分别为13.5 IU/mL和24.6 IU/mL。在培养体系和反应体系中分别加入200 g/L NMMO,Galactomyces sp. CCZU11-1纤维素酶仍具有良好的活性,表明其具有较高的耐NMMO性能及应用前景。