大肠杆菌高密度培养发酵L-色氨酸

为实现高水平的大肠杆菌高密度培养,提升发酵法产L-色氨酸的生产效率,以大肠杆菌TRTH为供试菌株,在初始发酵工艺的基础上,先后对发酵接种量和底物KH_2PO_4添加量各设置4个梯度进行发酵对比试验,并着重考察了底物KH_2PO_4添加量对菌体生长、产酸、磷酸盐消耗、糖酸转化率及副产物积累的影响。试验结果表明,在接种量为20%(体积分数),底物KH_2PO_4添加量为10 g/L时,最高菌体密度达到65. 39 g/L,最终L-色氨酸产量为59. 55 g/L,分别较优化前提高了45. 99%和31. 17%,发酵延滞期明显缩短,菌体生长迅速,原料利用率大幅提高,主要副产物积累量较低,发酵总体水平达到最优。为大肠杆菌高密度培养在L-色氨酸发酵中的应用提供了一个成本低、可行性高的新策略,同时为L-色氨酸发酵生产中底物磷酸盐的调控提供了参考。     

大肠杆菌发酵生产L-色氨酸过程中的质粒稳定性

研究L-色氨酸生产菌Escherichia coli TR TH07-09的质粒稳定性,在培养过程中考察了选择压力、温度、溶氧及酵母抽提物等因素对质粒稳定性的影响。结果表明该菌具有较好的结构稳定性和分裂不稳定性,在无选择压力和操作条件控制不当的情况下,质粒有一定程度的丢失。     

氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌E.coli TRTH为供试菌株,研究了氮源对L-色氨酸发酵的影响。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,确定了最佳有机氮源和无机氮源分别为酵母粉和硫酸铵,进一步确定酵母粉和硫酸铵的最佳用量为1 g/L和10 g/L,最后采用NaOH和氨水混合补料控制发酵液中NH4+浓度在120 mmol/L以下,发酵38 h,菌体生物量和L-色氨酸产量分别达到53.42 g/L和32.6 g/L,实现了大肠杆菌的高密度培养。     

精氨酸对Escherichia coli发酵生产L-色氨酸的影响

色氨酸是人和动物体内必须氨基酸,在食品、饲料及医药工业中具有广泛应用价值.以色氨酸生产菌株Escherichia coli TRTH为出发菌株,在培养基中添加精氨酸,以降低代谢副产物的积累量,提高L-色氨酸的产量.在30 L发酵罐上考察了精氨酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明:添加0.2 g/L的精氨酸时,菌体生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率分别为41.5 g/L,34.5 g/L和18.0％,较未添加时分别提高了5.46％,5.83％和2.86％,且乙酸积累量较未添加时降低了10.99％.     

谷氨酸合成途径基因缺失对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响

降低谷氨酸的积累可提高L-色氨酸产量及糖酸转化率。敲除Escherichia coli TRTH中的谷氨酸脱氢酶及谷氨酸合成酶编码基因gdh A、glt B,构建TRTHA(TRTH,Δgdh A)、TRTHB(TRTH,Δglt B),考察gdh A、glt B缺失对L-色氨酸发酵的影响。结果表明,gdh A及glt B缺失能有效降低谷氨酸的积累,但会降低细胞生长及色氨酸合成;培养基中谷氨酸的添加可恢复TRTHA及TRTHB的生长及色氨酸合成能力。在含1 g/L谷氨酸培养基中,利用TRTHB发酵L-色氨酸,L-色氨酸产量(41.23 g/L)及糖酸转化率(15.45%)最高,较TRTH分别提高了10.92%和7.89%;谷氨酸生成量(5.72 g/L)及乙酸积累量(1.73 g/L)分别较TRTH降低了25.23%及提高了10.19%。TRTH和TRTHB代谢流分析结果表明,glt B缺失会降低谷氨酸合成代谢流并提高乙酸合成代谢流;TRTHB的色氨酸合成代谢流(11.4%)较TRTH提高了40.74%。     

色氨酸转运系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响

近年来,转运系统改造已经成为氨基酸菌株菌种改良的重要手段。本研究以工业生产菌Escherichia coli MT-01/p Trp-01为出发菌株,首先利用Red重组技术,在菌株MT-01/p Trp-01基因组上敲除了色氨酸吸收基因mtr,发酵结果表明,敲除敲除突变菌的L-色氨酸产量达到35.87 g/L,与出发菌株E.coli MT-01/p Trp-01相比提高了32%;在此基础上,进一步考察了三种不同启动子（Pr,Ptac,Pser A）控制下L-色氨酸分泌基因ydd G的差异表达对菌体生长及菌株产L-色氨酸的影响。结果表明,当采用组成型启动子tac时,ydd G基因的过表达菌株L-色氨酸的产量为41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量提高了14.3%,当采用温度诱导型启动子Pr调控ydd G基因表达时,L-色氨酸的产量与mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量相比提高了9.3%,L-色氨酸的产量达到了39.22 g/L;而采用基因ser A的天然启动子调控ydd G表达时,菌体的生长受到了明显抑制,L-色氨酸产量仅有27.1 g/L的色氨酸。综上,大肠杆菌基因mtr的敲除和基因ydd G的过表达均可以有效提高工程菌株生产色氨酸的能力。      

有机氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌Escherichia coli TRP03为供试菌株,研究了多种有机氮源对L-色氨酸发酵的影响。 首先对不同来源的酵母 粉进行了优化试验,确定一种最优酵母粉,摇瓶发酵时L-色氨酸可积累10.21g/L;利用5 L发酵罐发酵1.5～3.0h时,细胞出现二次生 长现象,选择添加氨基酸粉和氯化胆碱促进细胞生长,经优化实验,确定同时添加氨基酸粉2g/L、氯化胆碱0.5g/L可在很大程度上解 决细胞的二次生长问题并提高L-色氨酸产量至44.21g/L;为提高中后期菌体活力及产酸能力,选择在不同发酵时期流加质量浓度为 1g/L的酵母粉、蛋氨酸及谷氨酰胺混合液,确定10h流加时,中后期的活细胞数提高了30.18%,保证了菌体活力。菌株E. coli TRP03经36h发酵,可积累L-色氨酸51.23g/L,较未经任何优化的菌株提高41.91%。     

稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响

为了解决现有L-色氨酸发酵工艺中浓糖补料和中途排料造成的乙酸积累过多和资源浪费等问题,该研究提出一种稀糖分罐 发酵的新工艺。 利用30 L发酵罐考察稀糖分罐发酵对L-色氨酸发酵的影响,在发酵中期（发酵时间为20 h左右）将部分发酵液移至另 一灭好菌的空罐继续进行发酵,并将浓糖替换为稀糖补料。 在稀糖分罐发酵工艺条件下,菌体生物量、L-色氨酸产量、糖酸转化率分 别为44.31 g/L、43.82 g/L、20%,较普通工艺分别提高了5.4%、9.9%和12.36%;乙酸积累量较普通工艺下降65.5%。 避免了料液的浪费, 提高了L-色氨酸产量和糖酸转化率,降低了乙酸积累量,在工业生产方面有一定实用性和推广价值。     

大肠杆菌发酵产L-色氨酸培养基及补料优化

为了进一步提高优化大肠杆菌发酵产L-色氨酸的产量,采用响应面法优化了原初始发酵培养基组合成分,建立了乙酸铵-玉米浆补料模式。结果表明优化后培养基组合:0.12%硫酸铵、0.7%磷酸二氢钾、0.15%一水柠檬酸、0.28%七水硫酸镁、0.05%酵母粉、0810 0.39%乙酸铵、0.3%玉米浆。5 L罐的培养验证表明,玉米浆和乙酸铵是影响L-色氨酸产量的主要成分因素,优化后L-色氨酸产量提高了35.4%,发酵结束达到24.53 g/L,单位菌体L-色氨酸产量提高了19.8%,达到0.272 g/OD,糖酸转化率提高了27%,为L-色氨酸发酵提供一定的参考。     

L-色氨酸混菌发酵工艺

为解决L-色氨酸发酵过程中乙酸、乳酸等抑制性副产物积累对对菌体活力和色氨酸积累造成抑制的问题,利用2株色氨酸生产菌,即大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223进行混合发酵,利用谷氨酸棒杆菌代谢大肠杆菌产生的乙酸、乳酸等副产物,降低乙酸等副产物对大肠杆菌发酵的负面影响。通过单因素试验确定了混菌发酵的最佳接种间隔时间为14 h,谷氨酸棒杆菌TQ2223接种量为7. 5%,培养温度为36℃,p H 7. 0。在最佳工艺条件下进行了30 L发酵罐小试验证,结果显示,与普通发酵工艺相比,混菌发酵工艺的乙酸积累量减少84. 8%,乳酸积累量减少82. 9%,L-色氨酸产量提高13. 6%,糖酸转化率提高19. 1%。为发酵法高效生产L-色氨酸提供了新方案,为混菌发酵在氨基酸发酵中的应用提供了理论依据。     

不同还原性碳源对重组大肠杆菌厌氧发酵生产丁二酸的影响

以过量表达苹果酸酶的大肠杆菌NZN111为出发菌株,考察菌体对不同碳源的利用情况,并用3L发酵罐以不同还原性碳源作为底物测定发酵过程中菌体生长、代谢物浓度以及NADH量和氧化还原电位值(ORP)的变化.结果表明,以甘露醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源时,丁二酸收率分别为99.7%,83.0%和40.5%,还原性越强的碳源发酵过程产生的NADH量越多,且NADH量随着发酵时间逐渐降低,发酵结束时ORP分别为-358mV,-367mV和-384mV.由此可知,还原性越强的碳源产生的NADH量越多,发酵结束时丁二酸产量越高,副产物乙酸产晕越低,氧化还原电位值越高.     

高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵

以野生型大肠杆菌Escherichia coli W为出发菌株,利用Red同源重组系统分别敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA),再通过无氧生长进化筛选过程,构建得到在厌氧条件下能有效生长,并以琥珀酸为主要发酵产物的重组大肠杆菌WS100(△ldhA,△adhE,△pflB,△poxB,△ackA)。利用15 L发酵罐进行厌氧发酵测定显示,经72 h发酵,菌体密度OD600最大值可提高至6.48,琥珀酸产量达到70.13 g/L,琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L.h),葡萄糖-琥珀酸转化率为76%。发酵液中副产物含量低,乙酸含量为5.34 g/L,乳酸产量仅为0.15 g/L,未检测到甲酸和乙醇生成。结果表明,厌氧条件下,该工程菌可有效利用低营养成分的无机盐培养基,在不表达任何外源基因的条件下可稳定高产琥珀酸,具有极大的工业化开发前景。     

大肠杆菌合成琥珀酸的代谢工程研究进展

琥珀酸是一种重要的平台化合物,广泛地应用于食品、医药和化工等领域,被美国能源部列为12种最具潜力的可大宗生产的 化学品之首。 大肠杆菌（Escherichia coli）是目前生产琥珀酸的主要菌株,利用生物法发酵生产琥珀酸因具有原料可再生利用、绿色环 保等优势而成为当今研究的热点。该文从代谢调控的角度出发分析总结了大肠杆菌在发酵产琥珀酸中所应用到的方法策略,如消除 竞争途径、过表达关键酶、提供还原能量、扰动磷酸戊糖途径等,着重突出了代谢控制发酵产琥珀酸方面的研究进展,并对今后的发 展提供了新思路。     

生物发酵法制丁二酸生产工艺的研究与应用

丁二酸是一种重要的化工原料,广泛用于食品、医药和化工等行业,市场前景广阔。微生物发酵法生产丁二酸具有高效、环保、可持续利用的特点,是一种新型的绿色化工生产工艺。本文介绍了微生物发酵法制备丁二酸的生产工艺并对其应用前景进行了展望。     

中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响

该文对前期构建的产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化,并对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比。结果表明,经过28代驯化后的菌株HBUT-L16以Ca（OH）2作中和剂时发酵效果较NaOH为中和剂时效果好,L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。与驯化前菌株HBUT-L的发酵结果相比,HBUT-L16以Ca（OH）2为中和剂进行发酵时,乳酸产量提高了4.4%,糖酸转化率提高了2.8%,生产强度增加了26.71%;而以NaOH为中和剂时,对驯化前后菌株的发酵效果影响不大,由此推测耐乳酸钠的驯化主要通过提高工程菌对乳酸根的耐受性而非钠离子的耐受性,来提高L-乳酸的产量。     

重组大肠杆菌利用不同培养基发酵产琥珀酸的研究

微生物发酵法生产琥珀酸具有广阔的应用前景,实验针对实验室构建的工程菌Escherichia coli WS100（△ldhA、△adhE、△pflB、△poxB、△ackA）在不同培养基中进行厌氧发酵,考察其发酵特性。分别采用NBS培养基和玉米浆培养基,在含4L发酵液的发酵罐中进行补料-分批发酵。发酵83h后,Escherichia coli WS100在玉米浆培养基中消耗葡萄糖96.17g/L,积累琥珀酸63.45g/L,生产强度和质量收率分别为0.76g（/L·h）和65.98%;Escherichia coli WS100在NBS培养基中消耗葡萄糖110.30g/L,琥珀酸的产量达到84.98g/L,生产强度和质量收率分别为1.02g（/L·h）和77.04%。实验结果表明,Escherichia coli WS100在玉米浆培养基和NBS培养基中发酵均有较高的琥珀酸产量,其中在NBS培养基中琥珀酸的产量、生产强度和质量收率均比在玉米浆培养基中高。