一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L- 缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032 中克隆出L- 缬氨酸合成途径上的限速酶--乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN 进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌- 黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10 为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B. flavum ATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L 罐发酵实验结果显示：在野生型菌株发酵液中检测不到L- 缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L- 缬氨酸积累达5.0g/L。     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

ilvBNC操纵子协同cimA基因过表达提高Corynebacterium glutamicum YILW L-异亮氨酸产量的研究

L-异亮氨酸是人和动物八种必需氨基酸之一,在生命活动中具有重要地位。乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径的关键酶(由ilvBN编码),α-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体。因此强化ilvBN的表达以及增加α-酮基丁酸的供应理论上可提高L-异亮氨酸的合成。cim A编码的甲基苹果酸合成酶可以催化丙酮酸和乙酰-Co A快速生成L-异亮氨酸前体α-酮基丁酸,从而增强主代谢流通量。本文采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW ilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得C.glutamicum YILWPtac。摇瓶发酵结果显示该菌株L-异亮氨酸产量和转化率分别较出发菌株提高了14.8%和18.6%。在此基础上过表达cimA基因,获得C.glutamicum YILWPtacp XMJ19cim A,其L-异亮氨酸酸产量和糖酸转化率分别较出发菌株提高了14.5%和42.4%。本研究可为氨基酸生产菌株的选育提供依据。     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

异源表达乙酰辅酶A羧化酶对大肠杆菌产脂肪酸的影响

以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组为模板,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增得到DNA分子量大小为1 815 bp和1 700 bp的乙酰辅酶A羧化酶α-亚基以及β-亚基,将目的基因连接到pXMJ19质粒,得到表达载体pXMJ19-accBC、pXMJ19-accD1,将其转化至表达菌株BL21,得到异源表达菌株BL21-accBC、BL21-accD1。使用气相色谱测定发酵液中脂肪酸含量。结果显示：重组菌株BL21-accBC与BL21-accD1经1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷有氧诱导20 h后,脂肪酸含量分别达到45.57 mg/g菌体干重和18.81 mg/g菌体干重,较对照菌株分别提高了266%和51.32%。     

L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因。连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响。经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L。      

棒状链霉菌中lat基因的突变及其对克拉维酸产量的影响

以棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585的染色体为模板扩增得到1条1.77kb的lat基因片段,并将其用于构建重组质粒pKCLES。将pKCLES由E.coli ET12567接合转移至S.clavuligerus中。重组质粒pKCLES与S.clavuligerus染色体中野生型lat基因发生同源交换,从而获得了带有阿泊拉抗性的突变菌株。对S.clavuligerus NRRL3585以及lat突变菌株的基因组进行PCR验证,且测定了这2种菌株的产头酶素C的能力。结果均表明,突变菌株中的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的pKC1139片段而遭到了破坏。另外,以HPLC法测定了这2种菌株在不同培养时间(72h和96h)下的克拉维酸的产量,结果显示,lat突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的2.3倍。     

羟酸还原异构酶基因多拷贝重组酵母的构建

利用PCR技术扩增出啤酒工业酵母QY的羟酸还原异构酶基因ILV5 ,在酵母YS5 8中表达时 ,羟酸还原异构酶活力提高 2～ 3倍。将ILV5基因与铜抗性基因插入到YEp3 5 2载体中得到重组质粒 pLZ -5C ,转化QY ,通过铜抗性筛选转化子 ,所得转化子的羟酸还原异构酶的活力明显高于对照菌株QY ,在发酵测试中 ,转化子产生双乙酰的量比原始菌株降低了 60 %。     

重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldh L)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldh L分别连接至表达载体p ETDuet,获得共表达质粒p ETDuet-ldh L-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/p ETDuet-ldh L-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。     

酿酒酵母苏氨酸合成酶缺失对高级醇生成量的影响

通过构建酿酒酵母苏氨酸合成酶基因(THR4)缺失的工程菌株,研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响。以质粒pUC-19为载体,KanMX抗性基因为筛选标记,构建了重组质粒pUC-TABK,经PCR扩增得到YAKanMX-YB重组盒,并以酿酒酵母AY15单倍体α5为出发菌株,通过醋酸锂转化和G418抗性筛选,获得THR4基因缺失的突变株α5-T7。将转化子和亲本菌株分别进行模拟酒精发酵及酒精浓醪发酵,发酵结束后进行发酵性能和高级醇生成量的测定。结果显示,与亲本菌株相比,突变株正丙醇生成量分别提高了1.61倍和2.6倍,异戊醇生成量分别提高了0.27倍和0.24倍,而异丁醇生成量没有明显差异,表明THR4基因缺失会使酿酒酵母高级醇特别是正丙醇生成量提高。     

曲虫治理效果分析

通过对曲虫治理应用研究效果的分析 ,结果表明 :质量效果提高 7% ,糖化力效果提高 80 % ,综合效果提高 92 7%。     

分离高温盐的工艺条件研究

文章利用不同温度下Na ,K ∥Cl-,SO2 -4 —H2 O四元体系相图 ,对通过物理方法分离高温盐中一水硫酸镁和氯化钠的工艺条件进行了分析。得出当循环母液和高温盐配成的浆料温度超过 5 5℃ ,浆料液体中氯化镁达到一定浓度时 ,才能分离出纯净的一水硫酸镁和氯化钠。     

蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella sinensis)菌丝体发酵液免疫活性的研究

对蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液(HSFL)制剂进行体内和体外免疫活性研究。结果表明:该制剂在体外对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞的转化能力显著增加,并且在体外显著提高了小鼠脾脏中NK细胞的活性;在体内实验中,该制剂可以显著改善DNFB诱发的小鼠迟发型变态反应;显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体发酵液制剂具有调节免疫的生物活性。      

核苷酸磷酸基团保护的研究

将谷氨酸钠、5′－磷酸鸟苷按1：1混合后，添加柠檬酸，然后用硬脂酸包覆，能够有效地保护核苷酸5′－位上的磷酸基团。其中，（5′－磷酸鸟苷＋谷氨酸钠）：柠檬酸：硬脂酸＝30.3:9.1:60.6时，5′－磷酸鸟苷的残存率可达93％。     

制革清洁化技术的进展

就皮化材料与清洁化制革的关系、目前传统制革工艺中存在的严重污染问题及针对这些问题近年来采取的新的方法进行了探讨,指出清洁化是我国制革行业的必由之路,清洁化制革工艺与皮化材料的关系非常密切,只有研发出相应新型的、高吸收的、功能型的、易降解型的各类化工材料,才合乎清洁化生产的要求。在制革工艺中采用生物酶制剂辅助浸水脱脂、无硫脱毛与无灰浸碱工艺、无铵脱灰/碱等改造传统工艺,减少污染;采取高吸收铬鞣、无铬或少铬鞣制,提高铬的吸收率或克服铬鞣的弊端;在染整中,合成并采用助剂辅助染料、复鞣剂和加脂剂等的吸收与结合。这几方面通过集成应用,方可减轻制革的污染,实现清洁化生产。同时,就皮革固废物的利用及水的循环使用问题提出些看法。     

女套装上衣尺寸自动生成系统的建立与实现

针对服装打版系统智能化程度低的现状,设计了服装尺寸自动生成系统.量取女套装上衣经典款式样板的细部尺寸参数,采用非线性主成分分析法对女套装上衣样板各特征指标的权重进行提取,利用多元回归分析建立服装结构设计数学模型.建立样板尺寸自动生成的理论模型,并通过编程加以实现.建立3层模糊综合评判模型对系统进行测试,实验结果表明,该...     

Improvement of Rates of Convergence of Iterative Methods of Variance Component Estimation

Exact relationships of quadratic forms for restricted maximum likelihood and the pseudo expectation methods were presented for balanced data and a model containing only one random factor. These relationships were extended to unbalanced data as approximations and schemes for improving the convergence rates of the two methods of variance component estimation were compared empirically using simulated data. The proposed scheme for restricted maximum likelihood was found inappropriate since it converged rapidly but to a different final estimate than usual restricted maximum likelihood. The scheme for the pseudo expectation method also converged rapidly and to the same final estimates as the usual pseudo expectation method, and hence is recommended as a means of obtaining a good prior for restricted maximum likelihood.     

锅炉过热器热偏差的治理与预防

该文从黑液喷射炉的生产工艺、机械设备的角度简要分析了造成过热器热偏差的原因,并重点讲述了所采取的一些必要的治理和预防措施,从而使热偏差对过热器造成的危害程度得到有效减轻.