重组葡萄糖脱氢酶酶学性质研究

葡萄糖脱氢酶可用于高纯度低聚果糖和葡萄糖酸钙的生产，一种重组葡萄糖脱氢酶表达、纯化后，对该酶酶学性质进行了研究。最适反应pH值8．4，最适反应温度37℃，在温度低于45℃条件下，酶活力稳定性好。在最适温度和pH条件下，以葡萄糖为底物时葡萄糖脱氢酶的米氏常数Km=20．09mmol／L，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）为底物时的米氏常数Km=0．10mmol／L。     

利用重组葡萄糖脱氢酶提高低聚果糖纯度

用IPTG（诱导基因工程菌）M15／pQE31-gdh表达葡萄糖脱氢酶，纯化，该重组葡萄糖脱氢酶用于高纯度低聚果糖生产研究。以含量为51．11％（低聚果糖／总糖）低聚果糖的产品为底物，葡萄糖脱氢酶（5U／g总糖）作用2h，将低聚果糖含量提高到61，37％，消除了48，81％的葡萄糖。以30％（w／v）蔗糖为底物，利用有果糖基转移酶活性的米曲霉GX0015（15U／g总糖）作用6h后，加入葡萄糖脱氢酶（5U／g总糖）协同作用4h，得到成分为：低聚果糖含量76．87％、葡萄糖11．05％、蔗糖含量5.21％的产品。由果糖基转移酶和葡萄糖脱氢酶组成的系统能够有效降低葡萄糖含量，提高低聚果糖含量。     

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达

扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）,构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21（DE3）后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP＋与NADPH循环奠定了基础。     

FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶发酵、纯化及酶学性质

细菌来源的FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)较为罕见,作者利用乳糖为诱导剂,发酵E.coli BL21(DE3)生产FAD-GDH。7.5 L发酵罐中培养该菌,通过分批补料,分阶段温度控制,酶活达到1341 U/L,菌体量达12.4 g/L。通过镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱三步层析对粗酶液分离纯化,获得比酶活109 U/mg的重组酶。SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组蛋白质纯化后呈单一条带,相对分子质量约60000。等电聚焦电泳检测酶的等电点pI为5.3。酶标仪全波长扫描吸收光谱表明,该酶的辅基为FAD,与酶非共价键结合。相比其它糖类,以葡萄糖为底物酶的Km最小,为2.56 mmol/L,kcat/Km为3487.7 L/(mmol·s)。该酶在pH 5.5~8.0内稳定,最适反应pH 7.0,当pH高于8.0时酶活迅速降低。差式扫描量热分析(DSC)测得酶的Tm值为77℃,热稳定性良好。本研究为该酶的进一步工业化生产应用提供参考与借鉴。     

低聚果糖合成酶──果糖转移酶的部分酶学性质研究

研究从土壤中筛选得到的黑曲霉ＡＳ００２３菌株所产的β－果糖转移酶的一些酶学性质。该酶的最适ｐＨ为５．０，最适温度为５０℃，有较好的热稳定性和较宽的ｐＨ（３．５～１０）适宜范围；并研究了１２种化学物质对酶活的影响和底物的特异性。结果显示，钴离子对该酶有一定的激活作用；底物分子越大其反应速度越慢。该酶的米氏常数Ｋ＿ｍ＝４７ｍｍｏｌ，葡萄糖是酶反应的竞争性抑制剂，其Ｋ＿ｉ＝３３０ｍｍｏｌ．当５０％（Ｗ／ｖ）蔗糖与酶在ｐＨ５．０和５０℃作用１６ｈ时，得到５２％（产物／总糖）低聚果糖。     

产环状糊精葡萄糖基转移酶菌株发酵条件和部分酶学性质的研究

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉等水解为环状糊精的酶,环状糊精因其特有的理化性质,在食品等领域有着广泛的应用。本实验以一株环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ-10为研究对象,分别对该菌发酵培养基的碳源、氮源和pH进行了单因子分析,并对这三个因素进行了正交实验,最终得到该菌的最佳发酵条件。对粗酶的酶学性质研究表明,酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH为9.0,酶学特性非常适合于环状糊精的工业化生产。      

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及部分酶学性质

取新鲜牛肝,经匀浆、缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得了电泳纯的牛肝谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）。经过纯化后的结果：GDH的酶比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60 倍,酶活回收率为23.12%。GDH的分子质量为380.2 kD,亚基分子质量约为61.7 kD。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50 ℃,在温度为30 ℃以下时较稳定;最适反应pH值为8.2,该酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的Km值为0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、Cd2+、Co2+、Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对该酶具有抑制作用,低浓度Ba2+、Mg2+、K+、Li+与乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）对其具有一定的激活作用。     

超表达葡萄糖脱氢酶促进大肠杆菌生长

通过PCR扩增了肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和大肠杆菌（Escherichia coli）各自的葡萄糖脱氢酶基因KPgdh和ECgdh,构建了表达载体p ET-28a-KPgdh和p ET-28a-ECgdh,转化大肠杆菌E.coli BL21,获得了重组菌BL21（p ET-28a-KPgdh）和BL21（p ET-28a-ECgdh）。经IPTG诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组菌实现了葡萄糖脱氢酶的高效表达,且葡萄糖脱氢酶活性分别是空质粒对照菌E.coli BL21（p ET-28a）的8.5倍和12倍。重组菌的生长速度快于空质粒对照菌E.coli BL21（p ET-28a）,并与原代菌E.coli BL21持平。如果扣除质粒复制造成的代谢负荷,过表达葡萄糖脱氢酶促进了大肠杆菌的生长。      

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM- 纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003 中获得电泳纯的具有1,2- 丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000 和50000。经MALDI-TOF MS-MS 质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH 值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3 个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等)对此酶活性均有抑制作用。     

重组高异构化率葡萄糖异构酶酶学性质的研究

葡萄糖异构酶催化D-葡萄糖形成D-果糖的异构化反应，是工业上制备高果糖浆的关键酶。介绍一种新型重组葡萄糖异构酶（rGI）的酶学性质。rGI的最适作用温度为90℃～100℃，最适作用pH为7．0。rGI具有较好的热稳性，90℃下的酶活半衰期约为5h。rGI酶活表达依赖二价金属离子。在90℃、pH7．0和5h下，rGI异构化30％（w／v）葡萄糖液为果糖的异构化率达到54．8％。     

大豆中植酸的酶法去除研究

利用小麦浸泡萌发时其内部的植酸酶去除大豆中的植酸。将大豆与民芽小麦按４：６的比例（干基）混合,打浆后,在５６￣５８℃,ｐＨ５．０￣５．２条件下处理３ｈ,植酸的去除率可达９７％以上。     

ON THE DIFFERING RATES OF FRUCTOSE AND GLUCOSE UTILISATION IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Fructose is utilised slower than glucose when the two sugars are fermented separately. This phenomenon occurs in a growth promoting medium as well as in brewers wort when using the brewing yeast Saccharomyces cerevisiae. The use of a fructose adjunct in wort at concentrations of 2% w/v and above, may result in residual concentrations of fructose to remain at the end of fermentation and consequently taint the beer with a sweet off-flavour. Glucose and fructose have no effect on maltose utilisation. Thus they do not exert catabolite repression on the maltose membrane transport system in the particular brewing strain of S. cerevisiae under investigation, when fermented in brewers wort.     

GLUCOSE OXIDASE REACTION FOR ESTIMATION OF GLUCOSE WITHOUT HORSERADISH PEROXIDASE. SOME MICROBIOLOGICAL AND FERMENTATION APPLICATIONS

An enzymic method has been developed for analysis of glucose. Glucose oxidase acts on glucose to produce hydrogen peroxide which acts to directly reduce the green Cu(II) 2–2′-bicinchoninate complex to a violet complex without horseradish peroxidase. A concentration range of 20–200 μM glucose was used but the reaction shows a linear range of 20–800 μM glucose. Interference is controlled by using a blank determination which has not been treated with glucose oxidase. The reaction has been used to estimate glucose levels in Saccharomyces cerevisiae fermentation and α-amylase, invertase and β-galactosidase reactions and coloured corn-steep fermentation media.     

甘薯糖蛋白SPG-1的分离纯化及其降血糖作用研究

经水溶提取、乙醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等步骤，从广薯98中分离到甘薯糖蛋白组分SPG-1，经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析鉴定，为单一组分甘薯糖蛋白纯品。SPG-的糖含量为98．4％，蛋白舍量为1．6％，等电点为5．03。通过灌胃给药，研究了SPG-1对正常小鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖的影响，结果表明SPG-1对正常小鼠的血糖没有明显影响（p〉0．05），对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有明显（p〈0．01）的降血糖功能。     

pH对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌生长及产酶的影响

为了提高重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶的产量和活力，研究了发酵过程中pH对重组大肠杆菌的生长及产酶的影响。结果表明，发酵液pH对菌体生长及酶活有显著的影响，控制发酵液pH可以显著提高菌体量和酶活，当控制pH为7．5时，菌体量和酶活最高。在5L发酵罐分批发酵培养时，控制pH为7．5时的菌体量和酶活分别可以达到OD600=19，总酶活为123U／g，分别比不控制pH高出29％和33％。     

酶法提取乌饭树叶色素的研究

在传统溶剂提取的基础上，研究了外加纤维素酶及果胶酶提取乌饭树叶色素的最佳工艺条件。结果表明，复合酶提取最佳条件为：纤维素酶与果胶酶配比2：1，酶解时间3b，提取时间3b；复合酶法提取工艺与传统的有机溶剂提取工艺相比，色素的提取率提高13．2％。     

海藻糖产生菌株发酵条件的研究

从土壤中分离得到的一株海藻糖产量较高酵母菌株,对其进行最佳摇瓶发酵条件的研究。最佳的发酵条件为：碳源为2%蔗糖,氮源为0.2%酵母膏和0.1%牛肉膏,发酵初始pH为4.5,接种量为8%,装液量为40mL。该摇瓶发酵酵母内海藻糖的产量为381.190μg/mL,比优化前的180.870μg/mL提高了2.1倍。     

牛乳中微生物的微波致死特性试验研究

牛乳营养丰富,是微生物的优良培养基.而这些微生物却是造成牛乳腐败变质的主要原因.为了探讨牛乳中微生物的微波致死特性,本文进行了不同功率下的牛乳微波杀菌试验.通过试验表明,牛乳中的微生物在微波功率为600w时致死特性最显著,同时也表明随着微波功率的变大,微波致死时间呈双曲线型下降,而生产效率呈线性逐渐增加.