酪蛋白体外消化过程中DPP-IV抑制活性的变化规律及其机制分析

近年来二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽已成为辅助治疗糖尿病的重要手段。本实验以牛乳酪蛋白为研究对象,采用体外胃肠消化模型水解,研究酪蛋白在消化过程中的消化特性和DPP-Ⅳ抑制活性变化情况,并采用液相色谱串联质谱法分析消化过程中DPP-Ⅳ抑制肽典型特征结构序列变化规律,旨在寻找酪蛋白在消化过程中DPP-Ⅳ抑制活性变化机制与典型结构肽变化之间的关系。结果显示:消化特性上,酪蛋白在消化过程中水解度及消化率均随消化时间延长而增加,而其消化产物的DPP-Ⅳ抑制率与未消化产物相比总体上也处于增加趋势,并于240 min时达到最高值58.04%,为120 min胃消化产物的2倍左右(23.22%),水解度及蛋白消化率与DPP-Ⅳ抑制活性之间可能存在某种关联。进一步基于液相色谱串联质谱法分析酪蛋白消化产物中具有DPP-Ⅳ抑制肽典型特征结构(Xaa-Pro/Ala-及Trp-Xaa-,以下均简称特征肽)肽段,胃蛋白酶消化产物中共鉴定出25条特征肽,分子质量主要集中在大于5 kDa,而胰酶消化组分共鉴定出48条特征肽,分子质量集中在小于1 kDa,结合热图结果,发现特征肽段数目及含量均随消化时间呈现增加趋势,与DPP-Ⅳ抑制活性变化规律类似,揭示了酪蛋白消化过程中DPP-Ⅳ抑制活性变化机制与Xaa-Pro/Ala-及Trp-Xaa-肽数目及含量紧密相关。     

仿刺参胶原蛋白源二肽基肽酶抑制肽虚拟筛选及分子对接研究

目的 采用生物信息学和分子对接方法筛选仿刺参胶原蛋白来源的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽。方法 以仿刺参胶原蛋白序列为对象,进行生物信息学分析和计算机辅助虚拟酶解,基于生物毒性、致敏性、水溶性及吸收、分配、代谢、排泄及毒性(absorption,distribution,metabolism,excretion,toxicity,ADMET)预测,筛选得到6条具有潜在生物活性的寡肽,氨基酸序列分别为CD、CQ、CS、GR、SM、MDG,进一步通过分子对接分析肽段与DPP-Ⅳ的结合活性,并分析其结合位点及方式。结果 生物信息学分析表明仿刺参胶原蛋白是生物活性肽的潜在优良来源,经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及模拟胃肠道虚拟水解后能够释放出DPP-Ⅳ抑制肽;分子对接表明俩条新肽段CS、SM通过氢键、疏水相互作用分别与DPP-Ⅳ的S1、S2活性口袋结合。结论 本研究提供了一种快速筛选刺参胶原蛋白中DPP-Ⅳ抑制肽的方法。     

核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及稳定性研究

采用5种商业蛋白酶水解核桃粕,评估水解物对二肽基肽酶4（DPP-Ⅳ）的抑制活性,优选出碱性蛋白酶作为水解用酶。研究确定了碱性蛋白酶水解核桃粕的最佳水解时间为5 h,然后通过超滤和SP Sephadex C-25阳离子交换树脂柱层析分离纯化碱性蛋白酶水解物得到核桃蛋白DPP-IV抑制肽,并对所得DPP-IV抑制肽的热稳定性、pH稳定性和模拟胃肠道消化稳定性进行了测试。结果表明,核桃蛋白DPP-IV抑制肽（025 mg/mL）DPP-Ⅳ抑制率（76.19%）比未分离纯化的水解物的提高了约3倍,其富含碱性氨基酸（含量34.36%）,尤其是精氨酸含量高达25.93%。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽在高温（121 ℃）、极端pH（pH 1.0和pH 11.0）和模拟胃肠道消化条件下,均显示出良好的稳定性,因此可用作控制血糖的功能性食品成分。     

酶法水解对罗非鱼下脚料蛋白功能特性的影响

以罗非鱼下脚料为原料,采用Alcalase蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶对其进行控制酶解,通过pH-stat法控制水解程度,制备不同水解度(1.0%～15.0%)的罗非鱼下脚料酶解蛋白,探讨酶的种类和水解度对其乳化性和发泡性的影响。结果表明:在水解度较低(3.0%～5.0%)时,酶解蛋白的乳化性和发泡性较好,随着水解度进一步增大,酶解蛋白的乳化性和发泡性均降低;比较而言,由中性蛋白酶水解得到的酶解蛋白乳化性较好,而风味蛋白酶水解得到的酶解蛋白发泡性较好;此外,pH值(2～10)对轻度酶解蛋白的乳化性和发泡性影响较大,在pH 4.0～5.0范围内,酶解蛋白的乳化性和发泡性最差。     

酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

为探讨酪蛋白糖巨肽(GMP)酶解物的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制作用,选择木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分别酶解GMP获得糖巨肽酶解物,选择甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为底物的发色底物法检测DPP-4活性。结果表明,GMP酶解物的DPP-4抑制效果优于GMP本身,并且随酶解时间的延长酶解物DPP-4抑制作用逐渐增加,其中GMP木瓜蛋白酶解物对DPP-4抑制效果最好,GMP木瓜蛋白酶酶解物作为DPP-4抑制剂具有潜在应用价值。     

二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的筛选研究进展

二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ;EC3.4.14.5/CD26)属于丝氨酸肽酶中脯氨酸寡肽酶家族成员之一,是目前糖尿病新药研发的热点之一。体内外研究显示胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有较好的抗糖尿病效应,但是由于其体内被以DPP-Ⅳ为主的酶降解,半衰期仅2min,因而限制了其在临床上的应用。研究表明DPP-Ⅳ抑制剂能延长GLP-1在体内的半衰期,从而有效地降低血糖。     

风味酶酶解小麦面筋蛋白动力学研究

研究Flavourzyme风味蛋白酶水解小麦面筋蛋白的酶解效率和反应动力学特性,调控和优化面筋蛋白的酶解工艺。研究结果表明,在该酶的最适作用条件(pH 6.0,55℃)下,10%底物,1%加酶量(酶与底物比),酶解12 h,可获得较高水解度(DH30%)和蛋白回收率(30%)。通过数学推导结合试验研究,建立了该水解反应的动力学模型。水解度(DH)和水解时间(t)的关系:DH=12.35ln[1+(2.923E0/S0-0.015)t],酶失活常数Kd约3 min-1。与试验结果相比,模型计算值与试验值吻合较好,说明该模型具有很好的实际应用价值。     

蛋白酶酶解液水解度对起泡性和乳化性的影响研究

研究了中性蛋白酶(AS.1398)、碱性蛋白酶(2709)和双酶协同作用水解大豆分离蛋白的酶解液水解度与乳化和起泡功能特性的关系.研究发现:酶解液起泡性随水解度的增加呈上升趋势,而在不同酶解液样品中,起泡性以中性蛋白酶(单酶)酶解液最好.当水解度为20%时起泡性达到了(360±2.46)%.乳化性随着水解度增加而逐渐下降,其中以双酶复合酶解液最差(水解度为25%时乳化性最差,为17.60±0.80 mL/g).     

牦牛乳酪蛋白肽分离组分对DPP-4活性的抑制作用

以牦牛乳酪蛋白为原料,研究牦牛乳酪蛋白水解产物及其分离组分对二肽基肽酶-4(DPP-4)活性的抑制作用。以木瓜蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白,水解产物采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离,以DPP-4抑制率为指标,分析水解产物和分离组分对DPP-4活性的抑制作用。结果表明,木瓜蛋白酶水解0.5 h获得的水解产物表现出最强的DPP-4抑制活性,抑制率可达(59.57±0.23)%,半抑制浓度(IC50)为0.67 mg/m L。经Sephadex G-25凝胶过滤分离将木瓜蛋白酶水解产物分成4个组分,其中第3个组分对DPP-4抑制作用最强,IC50值为0.583 mg/m L。研究结果表明,与牦牛乳酪蛋白相比,其水解产物的DPP-4抑制活性显著增强,经凝胶过滤色谱分离后的水解产物分离组分具有更强的DPP-4抑制活性。     

罗非鱼肉的酶法水解控制和复合研究

利用Flavourzyme、Protamex、Alcalase2 4L、Trypsin、Kojizyme、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和虾头蛋白酶对罗非鱼肉进行水解 ,以游离氨基酸态氮含量、TCA可溶性蛋白 (短肽 )含量和水解度为指标对酶解过程进行分析 ,研究了酶法水解的控制条件以及不同酶水解生成产物的特点 ,在此基础上选择控制酶解的方法以得到较高的TCA可溶性蛋白 (短肽 )含量 ,并进行了复合酶解的比较研究。     

双酶复合酶解制备花生短肽研究

该试验以水解度和蛋白质提取率作为评价指标,研究了碱性蛋白酶和风味蛋白酶双酶对花生蛋白酶解特性的影响。通过单因素和正交试验确定了双酶的最佳酶解条件为:酶解时间3 h、pH 9.0、温度55℃、酶比例(碱性蛋白酶:风味蛋白酶)为2∶3,总酶浓度5.0×103 U/g、底物浓度5%,花生蛋白的水解度(DH)达12.02%,蛋白提取率71.60%,多肽得率达59.58%。同时研究了双酶酶解过程中花生蛋白水解度、pH及蛋白提取率的变化规律。     

双酶复合水解对玉米蛋白酶解效率的影响

采用4种蛋白酶(Neutrase酶、Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶)对高底物浓度(24%)玉米黄粉进行双酶复合水解,研究复合水解对玉米蛋白酶解效率的影响。结果表明:除Alcalase酶与Protamex酶组合外,酶的加入顺序对酶解效率影响较大。Protamex酶和Neutrase酶与其他蛋白酶的复合效果相当。与单酶水解相比,双酶复合水解可有效提高玉米蛋白的酶解效率,尤其是Flavourzyme酶与Alcalase酶复合,可使水解度和可溶性蛋白含量分别提高26.85%和98.05mg/mL。     

小麦面筋蛋白盐酸脱酰胺工艺优化及其酶解敏感性

文以小麦面筋蛋白为原料,优化了盐酸对小麦面筋蛋白的脱酰胺工艺,比较了最佳脱酰胺工艺下的小麦面筋蛋白在胰酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶酶解过程中蛋白回收率和水解度的变化,并对其酶解36 h酶解液的自由基吸收能力(ORAC)抗氧化特性进行分析评价。研究结果表明,盐酸脱酰胺的工艺条件是:小麦面筋蛋白浓度为24%,0.30 mol/L的HCl,65℃,24 h脱酰胺;在该工艺条件下,胰酶酶解液蛋白回收率和水解度最高,酶解效果最好;高脱酰胺程度小麦面筋蛋白在胰酶酶解36h后酶解液的蛋白回收率和水解度高于低脱酰胺程度的酶解液;ORAC抗氧化特性分析表明高脱酰胺程度小麦面筋蛋白酶解液的ORAC值高于低脱酰胺程度的酶解液,其ORAC值最高为(689.67±10.22)μmol Trolox/g。     

酶法水解紫菜蛋白动力学研究

为阐明酶法水解紫菜蛋白的动力学特性,研究了酶解时间、初始pH值、温度、酶浓度、底物浓度对紫菜蛋白水解度的影响,建立紫菜蛋白水解动力学方程.结果表明:酶解温度50℃、初始pH 9.0为最适水解条件.紫菜蛋白的水解度随着酶浓度的升高而增强,随底物浓度的增加而减弱.在此条件下,碱性蛋白酶水解紫菜蛋白的动力学方程:X=3.597ln[1+(82.788E0/S0-3.058)t],总水解速率方程:am=297.8×(E0-11S0/297.8)×exp(-0.278x),为合理确定酶解反应实验的各种参数提供理论依据.     

碱性蛋白酶酶解玉米蛋白工艺条件的优化

通过对酶法水解玉米粉蛋白制备多肽的工艺进行了研究,试验以水解度(DH%)和氯溶解指数(X%)为指标确定了最佳酶解工艺条件.结果表明,在pH值10.5,酶解温度60℃,酶与底物比5%,底物质量分数8%的条件下酶解4 h,可使水解度和氮溶解指数分别达到49.7%和51.2%.     

双酶复合水解蜂蛹蛋白工艺研究

研究了脱脂蜂蛹蛋白的酶法水解工艺。以水解度和多肽得率为指标,从中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味酶中选出中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行双酶复合水解。采用单因素与响应面优化设计,得出最佳酶解工艺条件为:复合酶比例1︰1(g/g)、加酶量4.67%、p H 8.27、料液比1︰12(g/m L)、酶解温度48.44℃、酶解时间4 h。此优化试验条件下,蜂蛹蛋白理论水解度46.05%,实际水解度为45.89%。此工艺可推广应用于蜂蛹蛋白多肽产业化生产的备选工艺。     

中性蛋白酶水解玉米蛋白粉制备可溶性肽最佳条件的研究

通过对酶法水解玉米粉蛋白制备多肽的工艺进行了研究,实验以水解度(DH)和氮溶解指数(NSI)为指标确定了最佳酶解工艺条件。结果表明,在pH7.5、酶解温度50℃、酶与底物比2%、底物浓度5%的条件下酶解4h,可使水解度和氮溶解指数分别达到22.74%和23.86%。     

利用啤酒废酵母酶法制备蛋白肽工艺研究

以啤酒废酵母为原料,选用碱性蛋白酶(Alcalase)酶,制备酵母蛋白肽.分别从底物浓度、酶解温度、加酶量、酶解pH值和酶解时间等因素来研究Alcalasc酶对啤酒废酵母水解度的影响,并通过正交试验优化酶解条件,其最佳酶解条件为:酵母浓度20%、pH8.0、加酶量0.5%、酶解温度55℃、酶解时间16h.在此条件作用下,酵母的水解度(DH)可达38.2%,水解液中酵母蛋白肽含量可达5.32mg/mL.     

电子束变性处理对大米蛋白酶解效率的影响

利用电子束辐照(EBI)技术对大米蛋白进行变性处理,以水解度、多肽产率为评价指标,研究大米蛋白在不同酶作用下的酶解效果。研究发现,EBI变性处理能有效提高不同酶对大米蛋白的酶解效率,增加多肽产率,其中EBI辅助碱性蛋白酶水解效果最好,大米蛋白水解度提高(19.02±0.37)%,多肽产率提高(13.50±0.29)%。扫描电镜结果表明,EBI变性处理使大米蛋白表面结构完整性下降,颗粒化程度增加。二级结构中α-螺旋含量由(18.38±0.31)%下降到(4.46±0.43)%,大米蛋白分子灵活性增加。紫外光谱和内源荧光光谱分析表明,EBI变性技术使大米蛋白分子空间构象展开,包埋在内部疏水区域的活性基团暴露,有利于酶解反应的进行。     

风味蛋白酶水解菜籽蛋白中2S和12S条件的优化

通过单因素试验和正交试验,研究了风味蛋白酶对菜籽蛋白中2S(RP-2S)和12S(RP-12S)的水解条件。结果表明,水解RP-2S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)95LAPU/g,酶解温度50℃,pH 7.0,酶解时间3 h,此条件下RP-2S的水解度达33.64%;水解RP-12S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)85 LAPU/g,酶解温度50℃,pH 6.6,酶解时间3 h,此条件下RP-12S的水解度达19.97%。