应用国产改良型DMEM培养基培养CHO-C28细胞

目的 解决CHO-C28细胞在大规模培养过程中易增厚、脱落和不易维持的难题。方法 试验组用国产改良型DMEM培养基连续培养CHO-C28细胞2个月,对照组用进口和国产DMEM培养基,观察细胞贴壁、增殖、维持和分泌HBsAg情况。结果 试验组细胞贴壁和长满单层时间明显快于对照组,维持2个月细胞未出现增厚和脱落,分泌HBsAg量明显高于对照组。结论 使用国产改良型DMEM培养基培养CHO-C28细胞效果显著优于现用进口和国产DMEM培养基。     

固化床反应器大规模灌注培养CHO-C28细胞生产乙型肝炎病毒表面抗原

目的开发一种应用固定化反应器大规模培养CHO-C28细胞的灌注培养工艺,用于制备重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。方法利用自行研发的微型反应器以轴向旋转模拟固化床内培养基流经载体表面,分析固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞表达HBsAg的可行性;使用AP20小型固化床反应器进行小试工艺;将AP20反应器消化后收集的2.3×1010个细胞接种至AP200固化床反应器,对灌注工艺进行中试放大,收获培养液,测定溶氧、pH、葡萄糖、乳酸及HBsAg蛋白浓度,并与转瓶培养工艺进行比较。结果预装无纺纸片的微型反应器接种CHO-C28细胞后,可连续灌注培养60 d,HBsAg表达水平为1 100 ng/ml。AP20反应器接种CHO-C28细胞后,HBsAg表达水平在维持期约1 100 ng/ml;将AP20反应器培养至第10天的CHO-C28细胞消化后,收集2.3×1010个细胞,接种AP200反应器,可连续灌注培养60 d,生长期中,葡萄糖消耗速率最高可达450 g/d,维持期葡萄糖消耗速率降至250 g/d,整个维持期内葡萄糖浓度维持在约1.5 g/L,收液中乳酸积累量为22 mmol/L,HBsAg表达水平约1 200 ng/ml。固化床灌注培养工艺的工艺条件控制精度高,培养环境更适合CHO-C28细胞生长,培养周期与转瓶工艺相当。结论固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞工艺与转瓶工艺HBsAg表达水平相当,具备较高的产业化应用价值。     

国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的比较国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的差异。方法取批签发合格的国产疫苗1和2(酿酒酵母)、进口疫苗1(酿酒酵母)、国产疫苗3和4(汉逊酵母)、进口疫苗2(汉逊酵母)各3批,经背部皮下免疫BALB/c小鼠,3μg/(100μl·只),于免疫后7 d,处死小鼠,无菌取脾,制备脾细胞悬液,分离脾单个核细胞(mononuclear cell,MNC)。采用酶联免疫斑点(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)法测定小鼠MNC体外接受HBsAg刺激后产生的抗原特异性细胞因子IFNγ、IL-2、IL-4和IL-5水平及体外接受MHCⅠ类多肽S28-39刺激后产生的IFNγ水平。结果小鼠免疫酿酒酵母乙肝疫苗后,以HBsAg刺激MNC,国产疫苗1诱导产生的IFNγ、IL-2和IL-4水平均明显高于国产疫苗2和进口疫苗1,国产疫苗1和2诱导的IL-5水平均明显高于进口疫苗1(P均0.05);以S28-39刺激MNC,3种疫苗诱导产生的IFNγ水平差异均无统计学意义(P0.05)。小鼠免疫汉逊酵母乙肝疫苗后,以HBsAg或S28-39刺激MNC,进口疫苗2诱导的IFNγ和IL-4水平均明显高于国产疫苗3(P0.05);3种汉逊酵母乙肝疫苗诱导的IL-2和IL-5水平差异均无统计学意义(P0.05)。结论国产重组酵母乙肝疫苗诱导早期细胞免疫应答能力较好。     

甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1减毒株)的制备及其免疫原性

目的用甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)L-A-1减毒株制备甲型肝炎灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法用细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞(2BS株),感染L-A-1减毒株增殖病毒,收获含病毒的细胞,经裂解、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)6000沉淀、三氯甲烷抽提、凝胶过滤层析纯化后,甲醛灭活,氢氧化铝佐剂吸附,制备3批试验疫苗。按照《中国药典》三部(2010版)中甲肝灭活疫苗标准进行各项检定,并进行小鼠效力试验,计算半数有效稀释倍数;将疫苗于37℃存放5、10、15、20、25和30 d,考察疫苗的加速稳定性。结果甲型肝炎病毒经提取纯化后,抗原回收率达80%以上,杂蛋白去除率达95%以上;制备的3批试验疫苗各项检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;小鼠效力试验结果显示,半数有效稀释倍数分别为进口疫苗和国产疫苗的1.25~1.40和2.02~2.26倍;37℃保存30 d,疫苗的体外相对效力仍在合格范围内。结论制备了纯度较高的甲型肝炎灭活疫苗,其在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步规模化生产甲型肝炎灭活疫苗奠定了基础。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

生物反应器培养Vero细胞制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗

目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。     

抗人类共激活蛋白单克隆抗体的制备

目的制备抗人类共激活蛋白(CLP)单克隆抗体,并进行纯化。方法配制2×DMEM培养基,与等量的2.2%甲基纤维素溶液混合,加入HAT、胎牛血清等,配成半固体HAT选择性细胞培养基。用基因重组人CLP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS-2细胞融合后,直接在半固体培养基上克隆化培养,筛选可持续、稳定、高效分泌抗CLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对分泌的单抗进行鉴定后,制备小鼠腹水,经DEAE离子交换柱纯化,半饱和硫酸铵沉淀,G25凝胶过滤除盐。结果共筛选出14株分泌抗CLP单抗的杂交瘤细胞,其培养上清可与相对分子质量约16000的CLP抗原结合,抗体类型为鼠IgGa1型。多数克隆分泌的抗体相对亲和力大于1∶20000,14株克隆分泌的单抗分别对应3个抗原结合位点。纯化后的单抗纯度接近95%。结论已成功制备并纯化了抗人CLP单克隆抗体,为建立CLP免疫学检测方法奠定了基础。     

无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞的比较

目的对无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞进行比较。方法应用两种培养基采用小方瓶培养CHO细胞,观察细胞维持时间、培养过程的形态变化及对血凝效价的影响。结果应用无血清培养基(A)培养CHO-C28细胞虽然可维持细胞正常生长,但贴壁不好,逐渐降低(A)加量情况可得到相应改善。结论 目前无血清培养基尚不能完全取代含血清培养基用于培养CHO细胞。     

应用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞

目的采用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞。方法分别应用美国NBS公司的Celligen310型生物反应器和国产AP20SC型激流式生物反应器(单个细胞培养袋和4个细胞培养袋)连续灌流培养重组CHO细胞,连续培养35 d,每24 h收获1次,采用ELISA法测定细胞收获液中HBsAg的滴度。结果 Celligen 310型生物反应器培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续8 d,至第18天达最高水平(2.16μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.12μg/ml;国产AP20SC激流式生物反应器单个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续9 d,第18天达最高水平(2.20μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.08μg/ml,与Celligen 310型生物反应器相比,收液中HBsAg含量在2.0μg/ml水平持续时间无明显差异;国产AP20SC激流式生物反应器4个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续13 d,与该生物反应器单个细胞培养袋相比明显延长,第21天达最高水平(2.14μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.5μg/ml,明显高于单个细胞培养袋培养的细胞。结论国产AP20SC型激流式生物反应器可代替进口生物反应器对传代细胞进行大规模培养,用于人用疫苗的生产。     

APS作为重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗佐剂的安全性及免疫效果

目的 探讨黄芪多糖（APS）作为重组（CHO细胞）乙肝疫苗免疫佐剂的可行性。方法APS与重组（CHO细胞）乙肝病毒表面抗原（HBsAg）混合制成疫苗,进行了动物毒性试验、过敏试验及效力试验。结果 该佐剂毒性轻微,无过敏反应,同一剂量组动物血清抗-HBs阳转率高于Al（OH）3对照组。结论APS是一种很有潜力的疫苗佐剂。     

罗式电化学发光法在乙型肝炎疫苗质量控制中的应用

目的用罗式电化学发光法检测乙型肝炎疫苗(酵母)生产过程中纯化工序关键样品的HBsAg含量和疫苗的体外相对效力(RP),以取代雅培珠式EIA法。方法分别用科华板式EIA法、雅培MUREX板式EIA法、罗式电化学发光法与雅培珠式EIA法对比检测重组乙型肝炎疫苗(酵母)生产过程中纯化工序关键样品的HBsAg含量和疫苗的RP值,并分析3种方法的精密性。结果科华板式EIA法和雅培MUREX板式EIA法检测纯化工序关键样品的HBsAg含量结果与雅培珠式EIA法比较,差异均有统计学意义,且精密性均不佳;罗式电化学发光法检测纯化工序关键样品的HBsAg含量及疫苗的RP值结果与雅培珠式EIA法比较,差异均无统计学意义,且精密性均良好。结论罗式电化学发光法可以替代雅培珠式EIA法,检测乙肝疫苗(酵母)生产过程中HBsAg含量和疫苗的RP值。     

ISCOMS重组乙型肝炎疫苗的研究

目的　提高CHO细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的免疫原性。方法　采用透析法制备HBsAg免疫刺激复合物 (immunostimulatingcomplexes简称ISCOMS)。用放免法 (RIA)检测免疫小鼠的抗体滴度 ;标记胸腺嘧啶掺入法 (3H TdR)检测小鼠脾淋巴细胞转化率 ;CTLL 细胞株 XTT法检测IL 2活性。结果　经电镜观察ISCOMS颗粒呈蜂窝状 ,直径为 30～ 4 0nm左右。SDS PAGE分析 ,制备的ISCOMS颗粒HBsAg蛋白均由P2 3、GP2 7和GP30组成。用Bradfords法测定ISCOMS蛋白回收率为 4 1 5 0 %。免疫NIH小鼠结果显示ISCOMS重组乙肝疫苗和铝佐剂疫苗的ED50 分别为 10 3 2 2 5 5和 2 5 80 6 4 ;ISCOMS组的相对效力是铝佐剂组的 4倍。刺激指数 (SI)分别为 6 78± 2 32和 3 12± 0 5 4。IL 2水平分别是 10 2IU ml± 2 12IU ml和 4 95IU ml± 0 86IU ml。结论　ISCOMS重组乙型肝炎疫苗稳定性好 ,免疫原性强 ,抗体产生早 ,滴度高 ,并且能激起细胞免疫 ,有可能发展成为新一代疫苗。     

HBsAg与GM-CSF基因双表达载体的构建及其免疫效果

目的构建乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg)与GM-CSF基因的双表达载体,提高乙肝病毒DNA疫苗的免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将HBsAg基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点处,构建双表达载体pHIG。将pHIG转染到COS-7细胞中,检测瞬时表达情况,并用双表达质粒pHIG免疫BALB/c小鼠,检测免疫后小鼠血清中抗-HBs及其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子的数量。结果在转染pHIG质粒的COS-7细胞上清液中有HBsAg的表达,pHIG双表达质粒组比pVAX/HBs组抗体产生时间提前2周,抗体阳转率提高2倍,小鼠脾脏T细胞表面CD4+分子数量及CD4+/CD8+值均高于pVAX/HBs组。结论HBsAg与GM-CSF基因双表达质粒能引起小鼠特异性免疫应答,并可提高免疫效果。     

乙型肝炎免疫实施方案及效果考核

目的 评价乙型肝炎疫苗免疫实施方案和远期效果。方法 考核乙肝疫苗接种率、及时率、孕妇HBV筛检率和阳性率,并对1986年出生时接种乙肝疫苗的对象随访采血,检测HBsAg、抗-肿s、抗-HBc。并设免前本区及邻区乙肝疫苗未免疫者为内、外对照。结果 免后14年HBsAg阳性率在1％以下,与内、外对照相比下降幅度达90％,远期保护效果为81.23％。结论 免后14年仍无需加免。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。     

纤维连接蛋白的提取及其在细胞培养中的应用

目的从牛血清中提取纤维连接蛋白(Fibronectin,FN),并观察其在细胞培养中的作用。方法将明胶偶联于溴化氰活化的Sepharose-4B,采用亲和层析法从牛血清或粗提后的样本中提取FN,并检测其蛋白含量。用纯化的牛FN处理细胞培养板,观察细胞在板中的生长情况,并与在进口板中的生长情况进行比较。结果所提取的FN,其蛋白含量约为400μg/ml,电泳结果与FN对照品一致,均为两条主带。用其处理的细胞培养板,培养细胞的形态和密度与进口板比较无明显差异。结论用溴化氰活化的Sepharose-4B提取FN是可行的,且其在细胞培养中有良好的助黏附与贴壁作用,有助于细胞培养。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。