蓖麻DNA糖基化酶的序列与基因表达分析

为揭示DNA糖基化酶在调节蓖麻生长发育和影响基因印记过程中的分子机理,本研究基于蓖麻全基因组、利用生物信息学的方法结合转录组数据和RT-PCR半定量表达分析,鉴别蓖麻DNA糖基化酶氨基酸序列的结构特征、系统发生和表达形式。结果显示：三种DNA糖基化酶（DME、ROS和DML）氨基酸均为不稳定氨基酸,具有典型的与DNA结合和碱基切除修复有关的保守结构域;系统进化分析发现三种DNA糖基化酶在植物中同源性强,而且是独立演化的结果;在不同组织的表达上,蓖麻的DME和ROS基因具有相似的表达形式,即在根、茎和叶中不表达,在胚乳中表达最高,而DML在各个组织中都未检测到基因的表达。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。     

普通烟草DHQ-SDH基因家族分析

为明确DHQ-SDH基因在普通烟草中的功能,用拟南芥DHQ-SDH基因检索烟草基因组数据库,获得普通烟草DHQ-SDHs基因。利用生物信息学分析了Nt DHQ-SDHs的基因结构、蛋白质特征、启动子顺式作用元件和基因进化,用q PCR检测了Nt DHQ-SDHs的组织特异性表达。结果表明:普通烟草中有8个DHQ-SDHs基因。Nt DHQ-SDHs的编码序列在1 248~1 608 bp之间,编码415~535个氨基酸,蛋白质分子量为45.13~58.22 k D,均为稳定蛋白。Nt DHQ-SDHs的外显子和内含子数量相对保守,均含有8~10个外显子和7~9个内含子。基序组成和进化分析发现,8个Nt DHQ-SDHs被分为2个亚家族,分别来源于普通烟草的两个祖先种(林烟草和绒毛状烟草)。Nt DHQ-SDHs在普通烟草根、茎、叶和顶芽中都有表达。     

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。     

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

芸薹属AC基因组中SUC基因家族的鉴定与进化分析

为分析芸薹属AC基因组中SUC基因（负责蔗糖和质子同向转运的蛋白基因）家族的扩张与丢失,基于已公布的白菜和尚未公布的甘蓝及甘蓝型油菜基因组数据对SUC基因进行全基因组鉴定,并分析基因结构域特征、生化特征、进化关系和表达特性。依据HMMER程序构建的SUC基因家族的HMM（隐马尔科夫）模型,在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中,各检索出12、11和24个SUC候选基因;通过用SUC家族特征进行筛选,最终各保留了12、4和7个SUC基因;通过对SUC基因在拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的系统发育分析,SUC基因家族在芸薹属物种中分成了3个亚类。利用MCscan对这4个物种基因组的共线性分析,结果表明SUC基因家族成员在芸薹属物种基因组加倍后以及白菜和甘蓝杂交形成油菜以后发生了不同程度的丢失。同时,序列生化特性预测结果表明SUC蛋白是属于偏碱性的疏水性蛋白且结构稳定;表达谱分析显示,所有SUC基因基本上在所有的组织中都有不同程度的表达;启动子分析表明,SUC基因的启动子区富含LTRE、ABRE、MYC、MYB和W-box等逆境应答相关顺式作用元件,因而该基因可能也与抗逆性相关。     

烟草抗冷相关基因在两种不同育苗方式下的低温应答差异分析

为探究水旱两段式育苗技术抗低温胁迫的分子机制,利用生物信息学方法分析了烟草低温应答关键转录因子CBF（C-repeat binding factor）基因家族的进化关系、基因结构、保守结构域及其启动子顺式作用元件,进一步利用qRT-PCR分析两种育苗方式下（常规漂浮育苗和水旱两段式育苗）NtCBF基因家族、CBF-regulon基因和非CBF-regulon相关基因的低温应答模式。结果表明,NtCBF15~NtCBF21基因与拟南芥CBF5、CBF6基因进化关系相近,NtCBF1~NtCBF14基因与拟南芥CBF1~CBF4基因进化关系相近。NtCBF基因家族成员均具有motif 1/2/4/5保守蛋白结构域,表明该家族在进化过程中较为保守;其中,NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因启动子区具有低温响应元件。低温处理后,NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon基因中NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3的表达量均显著升高。推测NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及其下游调控基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在水旱两段式育苗抗低温胁迫过程中起重要作用。      

解淀粉芽孢杆菌的强启动子的克隆与鉴定

利用启动子探针质粒,从解淀粉芽孢杆菌XH7基因组中分离得到1个强度较高的启动子P28,该启动子在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶酶活为2 350 Miller U/m L,在枯草芽孢杆菌中的酶活为3 340 Miller U/m L。启动子的序列分析表明该启动子由σK因子识别,由2个启动子串联而成,分别为编码羧基末端加工蛋白酶的基因(ctp A)和编码转醛酶的基因(tal)启动子,为芽孢杆菌启动子库提供了一个新的选择。     

烟草CYP82E4基因启动子功能分析

烟碱转化是指在烟叶成熟期,烟叶中的烟碱大量转化成降烟碱,烟叶品质发生显著变化的过程。前期研究表明烟碱转化由烟碱去甲基酶一步催化完成,其编码基因为CYP82E4(NtE4)。为解析NtE4启动子功能,探究其调控机制,本研究通过在线数据库分析NtE4启动子上的顺式作用元件,预测其上游靶向转录因子;通过5’端缺失构建启动子融合GUS基因的重组表达载体并瞬时转化本氏烟,确定启动子活性区域。结果表明,NtE4启动子包含2个脱落酸、11个乙烯响应元件,9个WRKY和7个NAC结合位点等;-500～-1 000 bp是NtE4启动子核心区域,-500～-1 967 bp存在较多增强启动子活性的元件;预测ERF、WRKY和NAC为NtE4基因上游靶向转录因子;荧光定量表达分析显示ERF5、WRKY50和NAC29在叶片衰老过程中具有和NtE4相似的表达趋势。本研究将为阐明烟叶衰老过程中NtE4介导的烟碱转化机制提供理论依据。     

热带假丝酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子功能鉴定

热带假丝酵母是重要的工业生产菌株,但表达系统还不完善导致代谢工程育种手段受到限制。探索新的表达元件对热带假丝酵母的基因工程育种十分重要。本文通过多重序列比对从热带假丝酵母ATCC 20336基因组中扩增得到一个具有较高活性的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yeGFP3)作为报告基因,整合到热带假丝酵母基因组上并对其表达活性进行研究。通过分离300、550、750 bp和846 bp4个长度的启动子片段分别表达yeGFP3,转化XZX宿主菌获得P-1、P-2、P-3和P-4共4个转化子。荧光显微镜结果表明,随着启动子长度的截短,荧光逐渐减弱,前3个转化子的相对荧光强度分别为P-4的4.98%、9.84%和48.4%。同时分析了4个转化子的yeGFP3转录水平,转录水平分别为P-4的5.6%、13.8%和60%。初步判断PGK1启动子至少存在2个上游激活序列(UAS)。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

烟草ACS基因家族鉴定及二氯喹啉酸胁迫条件下的表达分析

二氯喹啉酸药害给烟叶生产造成较大影响。为明确烟草二氯喹啉酸药害的发生机制,对1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因家族进行了鉴定,并对二氯喹啉酸胁迫条件下的基因表达模式进行分析。结果表明,普通烟草共有26个ACS基因。染色体定位分析显示,23个ACS基因定位在染色体上,3个定位在scaffold上。亚细胞定位分析显示,ACS主要定位于细胞核或细胞质中。进化分析表明,ACS蛋白进化形成3个类别。序列比对显示,ACS氨基酸序列含有家族保守结构域和活性位点。启动子分析发现,ACS基因启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素反应共10种类型的顺式作用元件。表达分析显示,大部分ACS家族成员均受二氯喹啉酸诱导而上调表达。      

巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶侧翼调控序列的克隆与分析

研究表明八氢番茄红素合成酶( PSY)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素代谢途径中的第一个关键调节酶.本实验采用基于LAoPCR的基因组步移法分别设计两组基因特异引物pSP1-3及tSP1-3,克隆巴氏杜氏藻PSY( DbPSY)的启动子和终止子序列,并利用在线启动子分析软件分析其保守调控序列.最后利用生物信息学方法分析预测DbPSY的蛋白质结构.分析结果表明,DbPSY启动子具有两个保守调控序列:BOXLCOREDCPAL和GT1GMSCAM4,其中BOXLCOREDCPAL受紫外光诱导,上调下游基因的表达,GT1GMSCAM4受盐调控,促进下游基因的表达.蛋白结构分析表明,DbPSY的N端在邻近物种间具有较大的多样性.我们推测DbPSY的微调与启动子保守序列及蛋白质N端序列的多样性相关.     

高粱过敏性诱导反应基因家族HIR的鉴定及表达分析

为研究高粱HIR基因家族成员的表达特性,采用生物信息学分析方法和实时荧光定量（qRT-PCR）技术,对高粱HIR基因家族进行鉴定和分析。结果表明：高粱中有5个HIR成员（SbHIR1~SbHIR5）,分布于高粱第2、3、7、9、10号染色体上;系统进化分析发现高粱与玉米的亲缘关系最近;不同物种间及物种内HIR基因的有效密码子数相对保守;基因结构分析表明,高粱HIR基因内含子数为1~6个;Motif分析表明,高粱SbHIR2蛋白缺失Motif 5和Motif 8,其余高粱HIR成员均具有9个Motif;高粱HIR蛋白二级结构以α-螺旋为主;qRT-PCR分析显示,高粱HIR基因家族成员在根、茎和叶中表达量存在差异,且能响应脱落酸、赤霉素和flg22的胁迫响应。     

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生，为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异，克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列，对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因，NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2），其中ProNtCycB2-1来自于林烟草，ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草，这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件，以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件；（3）以GUS为报告基因，研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现，NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达，其中NtCycB2-1启动...     

生物转化法生产茶氨酸的重组大肠杆菌的构建

为构建生物转化法生产茶氨酸的基因工程菌，作者分析了影响大肠杆菌高效表达γ-谷氨酰基转肽酶的几个主要因素．将大肠杆菌JM109的ggt基因接入两种不同的质粒中后，转化大肠杆菌JM109，并在一定的条件下进行表达．通过对比E．coli JM109和转化子的γ-谷氨酰基转肽酶表达活性的不同，探讨了ggt基因的拷贝数、启动子的强弱等几个因素对γ-谷氨酰基转肽酶高效表达的影响．实验表明，将含有自身信号肽和启动子的E．coli JM109的ggt基因接入高拷贝的质粒pUC18中，仅提高ggt基因的拷贝数不能增加γ-谷氨酰基转肽酶的表达量．将含有自身信号肽但不含有自身启动子的E．coli JM109的ggt基因接入具有tac启动子的表达载体pEtac中，发现在强启动子tac的控制下，γ-谷氨酰基转肽酶的表达量提高至出发菌株的2．3倍．将构建的工程菌用于生物转化法生成茶氨酸，底物转化率相应地提高至出发菌株的1．7倍．     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。     

一种有效的黑曲霉启动子捕获探针的构建及其应用

启动子对基因的表达起着关键的作用,为获得黑曲霉强启动子,该文以柠檬酸生产菌株黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC 10142为出发菌株,运用启动子捕获探针和基因重组技术筛选菌株高强度启动子,并确定其核心启动区域。结果显示：以红色荧光蛋白基因（Rfp）为报告基因,潮霉素抗性基因（HygR）为筛选标记,构建黑曲霉启动子捕获探针质粒pN3,借助T-DNA随机整合到黑曲霉基因组,筛选具有高潮霉素抗性和强红色荧光表型的突变株,进而通过交错热不对称链式聚合酶反应（thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,Tail-PCR）获得整合位点上游核苷酸序列,测序确定该序列为糖苷水解酶基因启动子区（Pgh）,通过分析其具有多个转录因子结合元件。对Pgh启动子进行5’端缺失分析,获得6个不同长度5’端缺失的启动子序列,并与强启动子PglaA对比,根据报告基因Rfp表达情况确定启动子Pgh的-1 066～-766 bp为其核心区域。     

高效表达淀粉酶的工业酿酒酵母菌株的构建

将PCR扩增的扣囊腹膜孢酵母菌淀粉酶基因 ,与磷酸甘油酸激酶基因 1启动子和α 分泌序列一起插入含 2 μm的酵母穿梭质粒YEp3 5 2 ,构建酵母菌重组表达质粒并命名为pLA8α。用醋酸锂转化法转化工业酿酒酵母Sc 1 6,转化子培养上清液的淀粉酶活性为 6 8U/mL ,46%的淀粉被降解 ,SDS PAGE检测到约 5 5ku的蛋白条带。转化子在非选择条件下的遗传稳定性为82 %。