枯草芽孢杆菌PNG27生产凝乳酶的发酵工艺优化及分离纯化研究

通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken响应面试验设计对培养基成分及发酵条件进行了优化,使最终发酵液凝乳酶活力达到222.34±4.99 U/m L。采用乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛等分离手段对枯草芽孢杆菌PNG27凝乳酶进行分离纯化,得到电泳纯的凝乳酶。结果表明,酶的比活力达到794.30 U/mg,纯化倍数为8.29倍,最终回收率为4.25%,SDS-PAGE电泳分析凝乳酶分子质量约为42 k Da。     

重组微小毛霉凝乳酶的分离与纯化

用硫酸铵分级沉淀分离提取重组微小毛霉凝乳酶(GS115/pPICZαA-Mucor pusillus rennet),经过Sephadex G-75分子筛和DEAE-52离子交换2次柱层析纯化,酶的比活力由2078U/mg提高为10526U/mg,纯化倍数超过5倍,纯化的重组凝乳酶经SDS-PAGE电泳分析纯化的重组凝乳酶分子质量约为46kDa。     

辣木籽凝乳酶的提取分离条件优化

为给辣木籽凝乳酶的开发利用提供理论依据,以脱脂辣木籽粉为原料,采用盐法提取、硫酸铵(AS)分级沉淀和离子交换色谱法提取分离凝乳酶。通过单因素试验和正交试验对辣木籽凝乳酶的盐法提取条件进行优化,采用单因素试验对离子交换色谱法分离纯化条件进行优化,并采用SDS-PAGE和RP-HPLC对分离得到的辣木籽凝乳酶的分子质量和纯度进行分析。结果表明：盐法提取的最佳条件为料液比1∶10、提取温度30℃、pH 7.15、NaCl浓度0.3 mol/L、提取时间0.5 h;在20%～40%AS饱和度下的沉淀蛋白凝乳活性最好且蛋白质总占有率达61.71%;离子交换色谱法的最佳分离条件为进样质量浓度30 mg/mL、流动相pH 5.15、流速1.68 mL/min、流动相组成为0.05 mol/L醋酸钠+0.05 mol/L氯化钠,在此条件下辣木籽凝乳酶的凝乳比活力值达到24 SU/mg;该凝乳酶的分子质量主要分布在35～45 kDa,纯度达到90%以上。采用该方法能有效提取分离辣木籽凝乳酶,且能很好地保持其凝乳活性。     

辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽

基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,液相色谱-串联质谱法研究辣木凝乳酶对酪蛋白的酶切位点和水解特性,并分析该凝乳酶水解产生的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽。结果表明,辣木凝乳酶酶切κ-酪蛋白的Arg 93-His 94位点导致凝乳,区别于其他已报道的凝乳酶,具有明显特异性。酶作用下κ-酪蛋白的米氏常数Km=0.49 mg/mL,最大反应速率Vm=45.2 U/min,有效促进酪蛋白胶束的聚集和凝乳。该酶对α-、β-、κ-酪蛋白产生不同程度的水解,对α-酪蛋白的水解速度最快,说明其适用于软质奶酪的加工。以酪蛋白为底物,通过钡-乙醇沉淀法得到酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,CPPs）,产率为15.87%,得到的CPPs可以使钙沉淀推迟23 min,有利于钙离子被肠道有效吸收。以水牛乳为底物时,乳凝固后析出的乳清中含酪蛋白糖巨肽6.61 mg/mL,糖基化程度477.527 μg/mg。研究为新型植物凝乳酶的研发,及其在奶酪、酪蛋白活性肽等产品的应用提供科学依据。     

酒曲发酵产凝乳酶及其酶学特性研究北大核心CSCD

通过研究不同因素对酒曲发酵产凝乳酶的影响,确定适宜的产酶条件:酒曲添加量3%(质量分数),发酵时间4 d,培养基初始p H值为6.0,摇床转速120 r/min。利用乙醇分级沉淀对酒曲发酵液中的凝乳酶进行提取,得到体积分数为70%乙醇沉淀蛋白具有凝乳活力;进一步进行Sephadex G-75凝胶过滤得到纯化凝乳酶,并经SDS-PAGE电泳分析,确定酶的分子量为35.6 ku。对此纯化酶的酶学特性的研究表明,该酶的最适温度为40℃,p H值为5.4时酶活性最高,Ca2+,Zn2+,Mg2+和K+对酶活性具有促进作用,其中以Ca2+和Zn2+促进作用较强;Cu2+,Na+和Fe2+对酶活性有抑制作用,其中Cu2+的作用较为显著。该凝乳酶在干酪加工中具有潜在的应用前景。     

酒曲发酵产凝乳酶及其酶学特性研究

通过研究不同因素对酒曲发酵产凝乳酶的影响,确定适宜的产酶条件:酒曲添加量3%(质量分数),发酵时间4 d,培养基初始p H值为6.0,摇床转速120 r/min。利用乙醇分级沉淀对酒曲发酵液中的凝乳酶进行提取,得到体积分数为70%乙醇沉淀蛋白具有凝乳活力;进一步进行Sephadex G-75凝胶过滤得到纯化凝乳酶,并经SDS-PAGE电泳分析,确定酶的分子量为35.6 ku。对此纯化酶的酶学特性的研究表明,该酶的最适温度为40℃,p H值为5.4时酶活性最高,Ca2+,Zn2+,Mg2+和K+对酶活性具有促进作用,其中以Ca2+和Zn2+促进作用较强;Cu2+,Na+和Fe2+对酶活性有抑制作用,其中Cu2+的作用较为显著。该凝乳酶在干酪加工中具有潜在的应用前景。     

青海牧区产凝乳酶细菌多样性分析

为发掘性能优良的产凝乳酶细菌菌株,开发新型细菌凝乳酶。本文采用酪蛋白培养基从采自青海牧区土壤样品分离筛选产凝乳酶细菌,利用菌株16S rDNA基因序列对菌株进行鉴定并分析其多样性。结果表明,36个样品中分离得到21株产凝乳酶细菌,沉淀圈与菌落直径比值为1.41~5.5;分离菌株在不同培养基上凝乳酶和蛋白水解活性有明显差异,麸皮汁培养基中凝乳酶活性为11.3~1215.6 SU/mL,蛋白水解活力为14.6~59.5U/mL;21株菌中有14株菌属芽孢杆菌属(Bacillus),是产凝乳酶细菌的优势属;多样性指数分析表明,该地区产凝乳酶细菌具有丰富多样性。     

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶（I3EB99）的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21（DE3）表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为（15 870±1.17）SU/g,蛋白水解活力为（263.81±0.94）U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。     

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值(C/P)达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。     

酒曲根霉F34菌株凝乳酶的初步纯化及部分酶学性质的研究

采用50%和75%乙醇分级沉淀的方法,对凝乳酶进行粗提,得率为43.9%.然后采用Sephadex G75柱进行纯化,经冷冻干燥成酶粉,其活力达到13008SU/g.F34菌株凝乳酶的最适反应温度为50℃,在40℃保持60min凝乳酶活力保持稳定,在60℃保持5min则完全失活.在pH为5.5～7.2的范围内,随着pH的降低,凝乳酶活力逐渐升高,F34菌株凝乳酶活力保持稳定的pH在3.5左右.Ca2 、Zn2 、Fe3 、Fe2 对凝乳酶活力表现明显的促进作用,K 、Mg2 对凝乳酶活力表现微弱的促进作用,Na 、Cu2 、Co2 、Li2 对凝乳酶活力表现明显的抑制作用.