非洲猪瘟病毒P30蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化重组非洲猪瘟病毒P30蛋白,并进一步制备抗P30重组蛋白的多克隆抗体,为非洲猪瘟病毒诊断试剂盒的研发提供实验材料和理论依据。根据GenBank中非洲猪瘟结构蛋白P30序列,经密码子优化后合成相应的基因序列,构建重组表达质粒pET-32a-P30并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纯化后获得重组P30蛋白,并制备抗P30的多克隆抗体。结果表明:16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达12 h获得质量浓度为0.6 mg/mL以上的重组P30蛋白,Western blot证实原核表达的P30具有较好的免疫原性,ELISA检测纯化后的多克隆抗体效价高达1∶5120000,且具有良好的抗原特异性。     

重组人β干扰素-1b的融合表达及制备

通过融合表达获得无需复性的重组人β干扰素-1b(17Ser-β-IFN)。运用PCR方法扩增带有EK(肠激酶)蛋白酶酶切位点的人β干扰素-1b基因,构建重组表达载体pET32-a-EK-β-IFN-1b,通过工程菌(pET32-a-EK-β-IFN-1b/Qrigami DE3)表达融合蛋白TRX-β-IFN-1b。经纯化的融合蛋白,在一定的酶切条件下用EK酶酶切后,通过反相C18柱纯化获得高纯度的重组人β-IFN-1b,再经细胞病变抑制法测定其抗病毒比活性。结果表明,TRX-β-IFN-1b融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上,EK酶酶切效率不低于90%。制备的重组人β-IFN-1b的质谱分子量与理论值一致,抗病毒活性比国内外报道的相同蛋白高出2倍以上,达到4.5×107IU/mg。通过融合表达制备的重组人β-IFN-1b具有治疗多发性硬化症或肝炎的临床价值。     

双酶水解芝麻11S蛋白制备抗氧化肽的工艺研究

芝麻11S蛋白是芝麻蛋白的主体,研究其在水解过程中产生的多肽的抗氧化能力有利于深入了解水解芝麻蛋白制备抗氧化肽的作用机理,更好地指导实际加工生产过程。探索了混料酶(Alcalase和胰蛋白酶以酶活比为1∶1混合)水解芝麻11S蛋白产物抗氧化性的工艺条件。通过单因素试验讨论了水解过程中加酶量、p H、温度、时间、底物浓度这5个因素对水解多肽产率、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和总抗氧化能力的影响,确定了水解所需最适加酶量和底物浓度,并筛选出用于响应面优化试验的水解p H、温度、时间的范围。通过响应面优化试验,得到水解芝麻11S蛋白多肽产物抗氧化能力相对较高的工艺条件为:温度44.81℃,加酶量10 000 U/g,水解p H 8.6,底物浓度3%,时间1.96 h。在此条件下,实际测定多肽产率为(77.41±0.30)%,总抗氧化性为(1.40±0.02)mmol/L,DPPH自由基清除率IC50值为1.41 mg/m L,ABTS自由基清除率IC50值为1.06 mg/m L。结果表明,响应面所建立的回归模型方程准确可靠,而且与其他天然抗氧化肽相比,芝麻11S蛋白显示出较好的抗氧化活性,具有制备高活性抗氧化肽的能力,为进一步分离纯化芝麻11S蛋白抗氧化肽提供了参考。     

山竹多酚的分离制备及清除自由基活性研究

通过响应面法试验设计,优化山竹外果皮中多酚类物质的提取工艺,并对其清除自由基活性进行了研究.多酚浸提的最佳工艺参数为:乙醇溶液体积分数60%、液料比18∶1、浸提时间66 m in,在此条件下,多酚浸出率为11.38%.提取液经XDA—7大孔树脂柱层析纯化,得山竹多酚,样品多酚含量为87.19%,其清除DPPH、羟基自由、超氧阴离子自由基IC50值分别为:4.67 mg/L、41.4 mg/L和27.0 mg/L.     

大肠杆菌表达的重组新蛭素的生产工艺

为建立可产业化的大肠杆菌表达的重组新蛭素(neorudin,EH)生产工艺,主要采取从低密度到高密度发酵的优化思路,优化了发酵罐培养基和诱导时间;比较了超声破碎和反复冻融的目的蛋白提取方法;纯化工艺采用离子交换层析2步法进行:SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Source 15Q阴离子交换层析;所得产品用免疫印迹法鉴定,经HPLC检测纯度,凝块法检测抗凝比活性;最后对纯化产品进行结构确证,包括高分辨率质谱、C-末端测序、N-末端测序、二硫键分析.结果显示:优化后的发酵工艺确定基于TB培养基的高密度发酵工艺,菌体OD600可达40左右,每升菌体湿质量可达70 g左右,目的蛋白表达量约400 mg/L;菌体反复冻融离心上清经过纯化获得的目的蛋白HPLC纯度均大于97％,纯化收率为26.12％,抗凝比活性为1 024 ATU/mg,用高分辨率质谱检测其分子质量约为7 415.188 0 ku,N-末端、C-末端和二硫键均与理论相符.建立了EH在大肠杆菌中的高密度发酵和纯化工艺.     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

HD-8阳离子交换树脂纯化灰树花多糖及其抗氧化活性的研究

以脱蛋白率、脱色率和多糖保留率为指标,筛选出灰树花多糖纯化效果较佳的阳离子交换树脂HD-8,并对其纯化工艺进行考察,获得优化的工艺条件为:流速2BV/h(1mL/min)、上样量400mL(蛋白质含量为99.2mg)、上样的量做浓度0.248mg/mL(多糖提取液中蛋白质浓度),多糖纯度达62.66%.与其他工艺相比,采用HD-8树脂能有效地提高灰树花多糖的纯度且节约成本、操作高效;同时对灰树花多糖的体外抗氧化活性进行了评价.     

表达牛肉风味强化肽P.postoris GS115（pGAP9-16BMP）摇瓶发酵条件的优化

从碳源种类及质量浓度、氮源质量浓度、温度、pH等方面对构建的工程菌P.postoris GS115（pGAP9-16BMP）摇瓶发酵条件进行了优化.结果表明,最佳表达条件为：甘油30 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉20 g/L,挡板三角瓶装液量为30%,菌体生长阶段控制温度32℃,初始pH 6.0,培养96 h.在此条件下,牛肉风味强化肽BMP（Beefy Meaty Peptide）表达量最高为41.9 mg/L.     

重组精氨酸脱亚胺酶的制备工艺

研究了重组精氨酸脱亚胺酶(r ADIES)的30 L规模发酵、制备工艺及其生物学活性。将构建好的工程菌先进行摇瓶活化获得种子液,转入30 L发酵罐进行培养,用IPTG进行诱导表达;表达产物进行高压匀浆破菌、包涵体洗涤、溶解稀释复性后经DEAE阴离子交换层析柱和Butyl疏水层析柱纯化;通过SDS-PAGE和RP-HPLC等方法检测表达和纯度;用体外测活法检测活性。将工程菌进行放大培养并诱导表达,获得了相对分子质量在46 k Da的r ADIES。重组蛋白表达量占总蛋白的25%以上,经制备工艺获得的r ADIES纯度高于95%,酶活性为42IU。实验结果表明:该工艺具有可行性,可以获得较高活性的重组精氨酸脱亚胺酶。     

SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

数学优化方法在新安江模型参数率定中的应用分析

以3种数学优化方法及新安江(三水源)模型的理论为依据,介绍了优化方法在新安江三水源模型参数率定中的应用.将率定成果与API模型进行了对比,说明这3种优化方法在大宁河流域参数率定中应用效果良好,具有很好的参考和推广价值.     

齿轮—五杆机构的轨迹特性研究

采用计算机机构动画仿真的方法，对齿轮五杆机构的轨迹特性进行了研究。分析了该机构双曲柄存在的条件，两连杆铰接点Ｃ的轨迹曲线可到达的区域及该轨迹曲线形状随机构结构参数的不同而变化的规律，从而为齿轮五杆机构的轨迹综合提供了重要依据。     

霸县凹陷文安斜坡内带层序地层学研究

以文安斜坡内带深层为研究对象,应用高分辨层序地层学等方法研究识别隐蔽油藏.通过兴隆1井地层重新划分及高分辨率三维地震应用,将该区沙三、沙四段地层之间重新确定为不整合接触.在三级层序地层框架建立的基础上,刻画各体系域砂体展布特征,构建了坡折带控制沙四下自生自储岩性油气藏成藏模式.通过钻井实践,首次在霸县凹陷发现沙四下段含油层系及新的烃源岩层,实现了深层自生自储式油藏类型的勘探突破.     

密炼机转子的刚度计算

介绍了变截面梁变形计算的初参数法，运用该方法求密炼机转子的变形，并得到了精确的解。     

高等学校固定资产计提折旧问题探讨

中国现行会计制度规定,高等学校的固定资产不计提折旧。随着经济的发展和高等教育的改革,高等学校的经济成分越来越复杂,固定资产管理和核算中暴露出来的问题越来越突出。针对现行高校固定资产计价模式存在的问题,提出了对高校固定资产计提折旧的设想,研究了高校固定资产折旧的范围、折旧年限、折旧方法及会计处理办法。     

一类含间隙分布时滞的种群模型稳定性研究

主要借助螺线特性,对一类含间隙分布时滞的种群增长模型特征方程λ＋c＝d（1＋λT）     

红豆杉原生质体制备和培养研究

采用不同浓度的纤维索酶和果胶酶混合液对红豆杉种子的胚进行了处理,采用3％ 0.5％(m／v)的纤维索酶 果胶酶混合液效果好．得到了红豆杉胚原生质体;同时采用了B5、V-KM、MS3种培养基对所得到的原生质体进行了初步培养;实验结果表明．采用V-KM附加椰子汁(含天然植物激素)培养基培养胚性原生质体效果较好,并研究了植物激素的浓度和光照强度等对愈伤组织的诱导的影响,表明采用IAA和NAA对愈伤组织生长效果较好,光照强度在1000lx生长效果较好.     

浅析资产减值会计对利润的操纵

会计制度规定企业定期或者至少于每年年度终了，对各项资产进行全面检查，合理地预计各项资产可能发生的损失，并计提资产减值准备，既不高估资产或收益，也不少计负债或费用，从而避免虚增企业利润。但在实务中，一些企业却利用会计法规准则中的原则性，通过资产减值准备达到操纵会计利润的目的，本文即是从企业滥用资产减值入手，以实例来揭示企业计提秘密准备的意图，以引起业内人士的重视。     

扬声器的自滤波特性与D类功放失真的改善

应用动圈式扬声器的电—力—声类比等效线路对动圈式扬声器的频率特性进行了初步的研究,提出了利用扬声器的自滤波性能改善因D类功放移相网络引起信号相位失真的方法。同时,采用比较、反馈的方法对音频信号的谐波加以抑制,使得数字功放的总体失真指数下降。     

红土颗粒粒度的分维变化特征

借助分形几何理论,探讨红土在不同处理方法下其颗粒粒度的分维变化特征结果表明：红土的颗粒粒度具有线性分形结构的特点是客观存在的事实,其分维值的大小反映了土中颗粒粒度的分布情况,并与土的物理力学性之间存在一定的关系分维是描述土的颗粒粒度的一个新的特征参数