酶转化人参皂苷中间产品Rg3皂苷的分析

酶法改变Rb1、Rb2、Rc、Rd等人参二醇类皂苷制备低糖基次生皂苷,中间产品的主要成分除Rh2皂苷之外,还含有Rh3、Rh1、Rg3等稀有皂苷.以人参皂苷Rg3为目标,采用柱层析的方法来分离其中间产品,从43 g样品中分离得到Rh2组分19.2 g,Rh3组分2.42 g,Rg3组分4 g,并用沉淀方法提纯Rg3.通过HPLC检测,人参皂苷Rg3有20-R型和20-S型异构体,54%为20（R）-Rg3,46%为20（S）-Rg3.     

把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶生成的细菌筛选

采用TLC、HPLC等酶活力检测方法对Arthrobacter sp.3、Rhodanobacter sp.14、Rhodopseudo-monas sp.18和Enterobacter sp.20菌进行了菌种筛选。其中Arthrobacter sp.3、Rhodopseudomonas sp.18和Enterobacter sp.20菌发酵生成把人参二醇类皂苷PPD转化为Rg3、Rh2和苷元的特殊人参皂苷糖苷酶,Arthrobacter sp.3菌发酵产酶速度相对快一些。Rhodanobacter sp.14发酵主要生成能把人参二醇类皂苷PPD转化为Rd的人参皂苷糖苷酶。Rhodanobacter sp.14发酵生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性较好,Arthrobacter sp.3、Rhodopseudomonas sp.18和Enterobacter sp.20菌所生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性略差。综合各因素,选取Arthrobacter sp.3为目标菌种。     

把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶生成的细菌筛选

采用TLC、HPLC等酶活力检测方法对Arthrobacter sp．3、Rhodanobacter sp．14、Rhodopseudomonas sp．18和Enterobacter sp．20菌进行了菌种筛选。其中Arthrobacter sp．3、Rhodopseudomonas sp.18和Enterobncter sp．20菌发酵生成把人参二醇类皂苷PPD转化为Rg3、Rh2和苷元的特殊人参皂苷糖苷酶，Arthrobacter sp．3菌发酵产酶速度相对快一些。Rhodanobacter sp．14发酵主要生成能把人参二醇类皂苷PPD转化为Rd的人参皂苷糖苷酶。Rhodanobacter sp．14发酵生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性较好，Arthrobacter sp．3、Rhodopseudomonas sp．18和Enterobacter sp．20菌所生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性略差。综合各因素，选取Arthrobacter sp．3为目标菌种。     

人参皂苷酶Ⅲ型转化人参皂苷Rc制备稀有皂苷C-Mc

利用基因构建克隆的E.coli C41菌产人参皂苷酶Ⅲ型,研究了酶转化人参皂苷Rc制备高活性稀有皂苷C-Mc的方法。结果发现,人参皂苷酶Ⅲ型先水解人参皂苷Rc的3-O-末端葡萄糖基生成C-Mc1,再水解C-Mc1的3-O-葡萄糖基生成C-Mc。人参皂苷酶Ⅲ型水解4.8g的人参皂苷Rc,得到2.8g产物,经HPLC检测,其纯度为90%。经核磁共振检测,产物结构为20-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖基-20(S)-二醇苷元,即C-Mc。     

酶转化人参皂苷中间产品Rg_3皂苷的分析

酶法改变Rb1、Rb2、Rc、Rd等人参二醇类皂苷制备低糖基次生皂苷,中间产品的主要成分除Rh2皂苷之外,还含有Rh3、Rh1、Rg3等稀有皂苷。以人参皂苷Rg3为目标,采用柱层析的方法来分离其中间产品,从43 g样品中分离得到Rh2组分19.2 g,Rh3组分2.42 g,Rg3组分4 g,并用沉淀方法提纯Rg3。通过HPLC检测,人参皂苷Rg3有20-R型和20-S型异构体,54%为20(R)-Rg3,46%为20(S)-Rg3。     

三七提取中人参皂苷的转化

为提高三七自身含有的人参皂苷糖苷酶的作用,采用TLC和HPLC方法检测,研究了不同温度水提三七过程中人参皂苷的变化。结果表明,在80~100℃,15%以上三七中的人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1转化为Rg2、Rg3、Rh2、C-K等稀有人参皂苷;提高温度到110~121℃时完全转化;而人参皂苷本身对温度很稳定,在80~121℃不发生转化。这说明三七提取中人参皂苷的变化,主要不是温度的作用,而可能是自身酶等三七内部的特殊物质起的作用。     

三七提取中人参皂苷的转化

为提高三七自身含有的人参皂苷糖苷酶的作用,采用TLC和HPLC方法检测,研究了不同温度水提三七过程中人参皂苷的变化。结果表明,在80~100℃,15%以上三七中的人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1转化为Rg2、Rg3、Rh2、C-K等稀有人参皂苷;提高温度到110~121℃时完全转化;而人参皂苷本身对温度很稳定,在80~121℃不发生转化。这说明三七提取中人参皂苷的变化,主要不是温度的作用,而可能是自身酶等三七内部的特殊物质起的作用。     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究.结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉 5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28 ℃;酶反应的最适条件为25 ℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL.     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究。结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28℃;酶反应的最适条件为25℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL。     

Arthrobacter sp.No.3细菌酶转化三醇类人参皂苷Rg1生成Rh1的反应条件

为了提高Arthrobacter sp.No.3 GS 0202新细菌所产人参皂苷糖苷酶水解人参三醇类皂苷Rg1生成人参三醇类皂苷Rh1的能力,采用薄层层析法和高效液相色谱法,对该菌的发酵条件及所产糖苷酶的反应条件进行了研究.结果表明,在30 ℃发酵条件下,人参皂苷酶的诱导物人参茎叶总皂苷存在下,该细菌产生较好.其粗酶...     

酶解产物人参皂苷Rh2、Rh3的二氯甲烷层析分离

人参皂苷Rh2、Rh3具有一定的抗癌作用,而这些稀有皂苷在传统红参中的含量甚微.为了获得纯度较高的人参皂苷单体,将人参二醇类皂苷经酶转化等方法处理,得到以人参皂苷Rh2和Rh3为主的混合物.常压下,用二氯甲烷-甲醇作为洗脱液变换梯度进行硅胶柱分离,分别采用流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)= 7∶0.10、7∶0.13、7∶0.15、7∶0.18、7∶0.2、7∶0.3渐变梯度进行洗脱,当流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.3时,成功分离出人参皂苷Rh2和Rh3.经高效液相色谱检测,为反式的二十、二十二碳烯Rh3和顺式的二十、二十二碳烯Rh3(即Rk2)混合物,纯度达到95%以上;也得到较纯的Rh2,经高效液相色谱检测为20(S)-Rh2和20(R)-Rh2异构体的混合物,纯度达到85%以上.     

酶解产物人参皂苷Rh_2、Rh_3的二氯甲烷层析分离

人参皂苷Rh2、Rh3具有一定的抗癌作用,而这些稀有皂苷在传统红参中的含量甚微。为了获得纯度较高的人参皂苷单体,将人参二醇类皂苷经酶转化等方法处理,得到以人参皂苷Rh2和Rh3为主的混合物。常压下,用二氯甲烷-甲醇作为洗脱液变换梯度进行硅胶柱分离,分别采用流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.10、7∶0.13、7∶0.15、7∶0.18、7∶0.2、7∶0.3渐变梯度进行洗脱,当流动相V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.3时,成功分离出人参皂苷Rh2和Rh3。经高效液相色谱检测,为反式的二十、二十二碳烯Rh3和顺式的二十、二十二碳烯Rh3(即Rk2)混合物,纯度达到95%以上;也得到较纯的Rh2,经高效液相色谱检测为20(S)-Rh2和20(R)-Rh2异构体的混合物,纯度达到85%以上。     

酶反应产物中人参稀有皂苷F2与C-Mc的分离

原人参二醇类皂苷混合物经人参皂苷酶生物转化后可生成F2、C-Mc等7~10种稀有人参皂苷。天然人参中不含人参皂苷C-Mc,且F2的含量极低。在生物转化所得的人参二醇类皂苷酶反应产物中,分离纯化得到稀有人参皂苷F2与C-Mc,并进行HPLC检测。反应后得到粗产品40g,经脱糖脱色和硅胶柱分离后,成功得到稀有人参皂苷F23.49g,纯度为98.2%,得率8.72%;得到C-Mc 0.70g,纯度为82.2%,得率为1.80%。成功分离出了F2和C-Mc制品,建立了初步的分离制备方法。     

芦丁的酶法转化及其产物异槲皮苷的分离

利用微生物Absidiasp.R9g产的芦丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)转化芦丁制备异槲皮苷,采用硅胶柱层析法对酶解产物进行分离纯化。结果表明,24.0g芦丁的酶解产物,经分离可得到较纯的异槲皮苷单体13.1g,其得率为49.4%。通过高效液相色谱检测其纯度达到98.3%。     

生物转化制备红参Rh1皂苷组及成分分析

利用TLC和超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)分析已制备的Rh1组异构体,利用HPLC分析其异构体的质量比。Rh1组在TLC图谱中显2个斑点,经UPLC-MS的分析,确认红参皂苷Rh1组含有4种异构体,分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4;高效液相色谱检测结果表明红参皂苷Rh1组中4种异构体20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4的质量比为25.0∶18.8∶15.5∶40.7,4种异构体总质量分数在90%以上。     

人参皂苷Rb1单克隆抗体的制备与鉴定

用人参皂苷Rb1分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)反应合成了交联抗原GRb1-BSA(GRb1与BSA的结合比为10∶1)和GRb1-OVA(GRb1与OVA的结合比为8∶1)。以GRb1-BSA为免疫原,分5次免疫3只BALB/C小鼠,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,Hat筛选,有限稀释法克隆。建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。采用ELISA(酶联免疫吸附测定)间接法和竞争法检测抗体的特异性。结果获得了一只小鼠分泌抗体效价达1∶16000,并获得两株分泌GRb1的单克隆抗体的细胞系,分别命名为1F7和1G3,单抗检测显示在0.01~1μg/mL呈线性关系,GRb1的检测范围达50~350 ng/mL,两株单抗针对相同的抗原决定簇,制备的单克隆抗体可用于GRb1含量的检测和分离。     

酶解淡水鱼鳞制备水解胶原蛋白的研究

测定了几种常见淡水鱼鳞的基本成份和氨基酸组成,研究了酶解鱼鳞制备水解胶原蛋白的工艺,并采取正交实验对水解条件进行了优化.结果表明淡水鱼鳞主要由蛋白质和灰分组成,粗蛋白含量高达55%以上;氨基酸组成显示淡水鱼鳞羟脯氨酸含量丰富,是制备水解胶原蛋白的良好原料.正交实验结果表明:55℃、酶与底物比(E/S)为3%、酶解2h、底物浓度100g/L时水解效果最好,此时,水解产物分子量较小,且分布集中.