细菌原生质体融合育种技术及其应用进展

原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用,并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。     

茶树菇与鸡腿菇原生质体融合及再生

研究茶树菇与鸡腿菇原生质体制备、融合及再生。以菌龄4d 的菌丝体为原料,采用1% 果胶酶和1% 蜗牛酶混合酶液(体积比1:1),酶解4h,酶解温度为30℃,pH6.0 的0.6mol/L 甘露醇溶液为渗透压稳定剂,制备得到茶树菇与鸡腿菇原生质体。两种原生质体融合的最佳条件为：使用35% 聚乙二醇(PEG4000)和0.2mol/L CaCl₂ 溶液(pH10)为助融剂,30℃融合30min。利用灭活原生质体作为标记筛选出融合子,融合的细胞在培养基中实现再生,通过菌落表型的比较和拮抗实验验证再生出的为融合子。     

金针菇与平菇远缘亲本原生质体融合研究

以菌龄5 d的菌丝体为原料,采用1.5 %溶壁酶和1.5 %蜗牛酶酶液,酶解3 h,酶解温度为30 ℃,0.6 mol/L KCl为渗透压稳定剂,制备得到金针菇和平菇原生质体。两种原生质体融合后,25 ℃静置培养2 d随后涂布于再生培养基。以34 ℃菌丝培养温度作为标记筛选出融合子,融合的细胞在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基中实现再生,通过菌丝形态、细胞学观察、拮抗性试验、出菇试验验证再生出的为融合子,最终从18个再生菌株中选择出1株耐34 ℃高温菌株可进行出菇试验,且融合菌株子实体粗壮、原基形成较多、菇形好的金针菇新品种,命名为F1P8。     

基于形态特征和ITS序列分析秦巴山区黑木耳主要栽培种的亲缘关系

采用CTAB法提取黑木耳菌株的DNA,进行PCR扩增,扩增产物进行测序。耳2和标准菌株Auricularia auricula-judae HF-8(GQ168492)聚类在同一分支上;耳913和标准菌株Auricularia auricula-judae YBS-7(GQ168503)聚类在同一分支上,且神农A8与新科、耳2、耳913亲缘关系相对较远。耳97-2和标准菌株Auricularia auricula-judae NW482(EU520194)聚类在同一分支上;耳268和标准菌株Auricularia auricula-judae NW491(EU520160)聚类在同一分支上,且秦单4#与耳97-2、耳268亲缘关系相对较远。新科、耳2、耳913、神农A8此4个菌种亲缘关系比较近;耳268、秦单4#、耳97-2等3个菌种亲缘关系较近。通过黑木耳菌株的形态观察及ITS序列分析,得到两株亲缘关系较远的优势菌株秦单4#和神农A8。     

原生质体融合技术

原生质体融合技术是在没有细胞壁阻碍的条件下,由PEG(聚乙二醇)助融,使两个亲株整套基因相互接触、交换、组合,得到多种类型的重组子,从而获得新的优秀菌株的技术。该项技术在细菌、酵母菌、链霉菌和霉菌等方面的研究和初步应用,为工业微生物遗传育种,开辟了广阔的前景。     

米曲霉种内原生质体融合选育优良菌株

米曲霉HL和L5是来自酱油酿造企业的生产菌株。HL的生长速度快,而L5的中性蛋白酶活力高。以HL和L5为亲本,进行原生质体融合,筛选得到一株融合株R6。融合株比亲本株生长速度更快,孢子成熟时间快3h,中性蛋白酶活力分别比2株亲本菌株提高25.6%和19.9%,酱醅氨基氮值也比亲本菌株提高8%和5.6%。     

细菌的原生质体融合

本文评论了有关细菌原生质体融合研究的进展,并报道了作者的部分研完工作。本文较充分讨论了原生质体融合的基本枝术步骤,包括出发株的选择,原生质体的制备,融合,再生,筛选和特性验证。介绍并推荐以育种为目的的该技术的较适使用条件。     

原生质体紫外诱变育种

利用原生质体融合技术,将具有不同性状特性缬氨酸菌株融合紫外诱变、再生,抗结构类似物筛选出高产菌株。     

利用种内原生质体融合技术选育双抗优良酿酒酵母的研究

酵母属（Saccharomyces）中的一些种对野生酵母或某些细菌具有抗性作用。采用005毫克／毫升酵母裂解酶制备的两种酵母原生质体在35％PEG－6000作用下，成功地获得了酿酒酵母的种内融合重组子。融合子具有抗野生酵母和部分细菌的双抗性。经过十代以上的移接验证，融合子的稳定率达到30％。结果表明，两支菌株融合后，抗药特性、营养缺陷、抗野生酵母和抗细菌性可以互补；融合子由于细胞基因拷贝数增加，使代谢物的产生量也增加，这对于保障纯种发酵及产品质量的稳定性具a重要作用。在酿酒酵母的融合育种中，嗜杀葡萄酒酵母、啤酒酵母的有种…     

原生质体融合提高产谷氨酰胺转氨酶菌株产量

目的：研究并建立产谷氨酰胺转氨酶茂原链霉菌原生质体制备技术,通过原生质体融合技术筛选高产菌株。方法：以溶菌酶处理茂原链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合技术,通过96 孔板高通量初筛、试管复筛、摇瓶验证选育高产菌株。结果：茂原链霉菌形成的原生质体再生出的菌落直径比较小,而菌丝生成的菌落直径比较大,两种形态的菌落96 孔板发酵后酶活力有显著性差异。不同的茂原链霉菌株制备原生质体,酶解程度、原生质体纯度、再生率有很大的差异,再生率最高可达1 804.25%,最低仅为12.76%。原生质融合后的高产菌株,选取96 孔板初筛酶活力前3%的菌株进行试管发酵,得到高产菌株比例为32.2%,酶活力比亲本高22.4%,经摇瓶验证产酶比对照提高16.28%。结论：利用基因组重排技术,可以初步对茂原链霉菌进行高产菌株选育。     

黑木耳核桃复合乳饮料的研制

以黑木耳、核桃仁为主要原料,加工成一种新型复合乳饮料。通过复配试验和正交试验对饮料的配方和稳定性进行研究,得到最佳配方为:原汁含量8%,黑木耳汁与核桃乳的比例为4∶6,白砂糖7%,柠檬酸0.2%;复合乳化稳定剂的添加量为:CMC-Na 0.10%,黄原胶0.15%,单甘脂0.05%,蔗糖酯0.20%。     

富硒黑木耳营养成分研究

以富硒黑木耳为原料,对其相关营养成分进行提取和分离。结果显示,样品总硒的质量分数为5．148mg/kg,蛋白硒占总硒的质量分数为52．03％,多糖硒占总硒的质量分数为22．64％。施硒量与富硒黑木耳中粗纤维质量分数成反比;而施硒量对富硒黑木耳中粗灰分质量分数影响不大。     

黑木耳多糖的酶法提取、纯化及性质研究

本文以双酶法提取黑木耳粗多糖,利用DEAE-Cellulose 52和Sepharose CL-4B柱层析对其进行纯化,以Sephadex G-100凝胶柱层析测定了多糖的分子量。结果表明黑木耳多糖含有两个主要组分APE Ⅰ和APE Ⅱ,分子量分别为31.7×104和18.3×104,均为非淀粉类多糖,不含单糖、蛋白质、核酸及多酚类物质。     

木耳黑色素碱法提取工艺优化及表征

采用正交试验优化碳酸钠提取木耳黑色素的工艺,并对黑色素的稳定性和结构进行分析。结果表明,单因素及正交试验确定最优工艺条件为：超声功率160 W（5 g固体物料）、料液比1∶30（g/mL）、碳酸钠浓度2.00 mol/L、提取时间50 min。在此工艺条件下获得木耳黑色素粗提物的产量为9.078 g/100 g。化学表征证明,木耳黑色素对温度、低浓度氧化剂和还原剂有较强的稳定性,但对光的稳定性较差;木耳黑色素在波长210 nm处有最大吸收峰。红外结果显示,木耳黑色素由羟基、氨基、C＝O、C＝C、CH、CH2以及芳环基团组成。木耳黑色素的S∶N=0.01,表明木耳黑色素为真黑色素,预示其具有乌发、抗衰老等作用。     

硒元素对黑木耳深层发酵的影响

为了获得富硒黑木耳菌丝,提高黑木耳菌丝的产量,改善黑木耳菌丝的品质,以亚硒酸钠作为硒源,用不同碳源有机物和氮源有机物进行黑木耳的深层发酵,研究pH值和温度对黑木耳深层发酵的影响。实验结果表明,黑木耳菌丝生长的最佳条件为：葡萄糖作碳源,豆饼粉作氮源,pH5.3,温度28℃。在此最佳条件下加入不同浓度的亚硒酸钠溶液进行培养,通过测定黑木耳菌丝的生物量,粗多糖含量和硒吸收率,表明亚硒酸钠浓度在60mg/kg以下时可提高黑木耳菌丝产量;在60～100mg/kg之间时会降低黑木耳菌丝产量;而在60mg/kg时,硒的吸收率达到最高。     

黑木耳米酒酿造工艺研究

以黑木耳、糯米为原料,通过单因素试验研究黑木耳添加量、甜酒曲接种量、发酵温度、发酵时间对黑木耳米酒酿造工艺的影响,在单因素试验基础上,以感官评分为响应值,采用Box-Behnken中心组合试验设计建立数学模型,进行响应面优化设计。结果表明,黑木耳米酒最佳的酿造工艺条件为黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接种量为1.0%、发酵温度30 ℃、发酵时间47.5 h,在此条件下酿造的黑木耳米酒的感官评分为91.6分,米酒理化指标为还原糖含量6.84 g/100 g、氨基酸含量为10.73 g/100 g、酒精度9.75%vol、总酸0.78 g/100 g,其中还原糖及氨基酸含量较糯米单独发酵增加率＞60%,黑木耳米酒呈褐色,清澈透明,有典型的黑木耳特有清香及米酒香气,酒味醇厚。     

碳酸钠脱色对木耳可溶性膳食纤维性质的影响

目的通过对木耳可溶性膳食纤维理化性质的研究,分析碳酸钠脱色对木耳可溶性膳食纤维性质的影响。方法测定脱色前后可溶性膳食纤维的水合能力(持水力、结合水力、膨胀性)、吸附性(持油力、吸附胆固醇能力、吸附亚硝酸根离子能力)、扫描电镜和红外光谱图,确定碳酸钠处理对可溶性膳食纤维性质的影响。结果碳酸钠脱色处理使木耳可溶性膳食纤维表面变得疏松多孔、层次分明,与未脱色木耳可溶性膳食纤维相比化学组成基本相同,结合水能力略有降低,但吸附性有所增强。结论碳酸钠处理改变了木耳可溶性膳食纤维的表面结构,减少了亲水基团的数量,但其基本性质变化较小,不影响木耳膳食纤维的正常应用。     

黑木耳中不同形态的铬在in vitro系统中生物可给性分析

利用In vitro系统模拟黑木耳在消化过程中不同形态的铬的生物可给性,采用HPLC-ICP-MS测定不同形态铬的含量。结果表明:29个样品经过In vitro系统模拟消化后,铬在胃中的生物可给性为15.10%～35.87%;在肠中的生物可给性为11.02%～20.36%,同一样品胃中的生物可给性铬大于肠中的,且检测出的铬均以三价形态存在。可以证明在In vitro系统中,黑木耳能有效吸附对人体有害的Cr(Ⅵ)。对0.5μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混标测定7次,RSD在2.55%～4.98%之间,方法重现性较好;对同一样品设置6平行实验,测量结果相对偏差均小于9.5%,说明该方法的精密度能够满足实验要求。可见,黑木耳的生物可给性铬是对人体有益的Cr(Ⅲ),且证明了在模拟消化过程中黑木耳能够完全吸附对人体有害的Cr(Ⅵ),为黑木耳中铬在消化过程中可能发生的形态转变及生物有效性提供了数据参考,也为研究制定菌类中铬的限量标准提供参考。     

复水黑木耳热风干燥特性的研究

进行复水黑木耳人工干燥设施设计、干燥工艺条件确定和速食黑木耳开发,研究黑木耳在热风干燥条件下的干燥特性。结果表明,相同干燥温度下,热风流速越大,干燥速率越快,干燥的预热和恒速阶段比较短而降速阶段的时间长。