易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性

近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明:F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变:D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

黑曲霉DL08内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

通过反转录PCR(RT-PCR)从黑曲霉(Aspergillus niger)DL08中提取内切葡聚糖酶基因(GeneBank No.KJ437592),PCR测序表明该基因全长999个核苷酸,编码332个氨基酸,预测相对分子质量为36.75 kDa,等电点(pI)为4.38,命名eg1。结构域分析表明,该蛋白包括18个氨基酸构成的信号肽和C末端1个糖基水解酶家族5的催化结构域。重组内切葡聚糖酶蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,酶学性质研究表明,以羧甲基纤维素钠为底物时重组酶最适作用pH为5.0,最适作用温度为45℃。通过薄层层析法检测重组内切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纤维素钠的产物,主要为连续寡糖。这些特性为纤维素酶酶解纤维素生产生物化学品和可再生生物燃料提供技术参考。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

绿色木霉内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

采用DEAE-650C弱阴离子交换层析、CM-650M弱阳离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析和Octyl Sepharose CL-4B疏水层析等分离纯化技术,从绿色木霉M1发酵液中分离纯化得到4个电泳纯的内切葡聚糖酶组分(EG1、EG2、EG3和EG4),比活力分别为41.83,139.96,117.72,126.50 U/mg,分子质量分别为25.4,28.8,56.3,60.5 ku,最适反应温度分别为50,45,55,60℃,最适反应p H分别为6.0,5.0,4.0,5.0,米氏常数Km值分别为9.51,5.06,4.16,4.86 mg/m L。组分EG1、EG3和EG4在30~50℃范围较稳定,组分EG1、EG2和EG4在p H4.0~6.0范围稳定性较好,而组分EG3只在p H5.0的条件下较稳定。Zn2+、Mg2+和K+对组分EG4有激活作用,对组分EG1、EG2和EG3有抑制作用,Ca2+对组分EG1、EG2和EG3有激活作用。     

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分,多基因的共表达在各领域有重大的应用价值,本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性,在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因,实现了不相容性共表达,获得了产两种酶的工程菌,酶活力可达1196.8U/mL。比单一酶组分的酶活力高,酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度60℃,在pH5⁷范围内能保持较高活性,酶活可达最高酶活的80%以上,在30⁶0℃范围能有较高的温度稳定性,酶活维持在80%以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。      

分子对接和定点突变提高内切菊粉酶的催化活力

内切菊粉酶可以有效地水解菊粉得到低聚果糖(inulooligosaccharides,IOS).低聚果糖是一种强效益生元,对人体健康有益,具有广泛应用价值.前期研究获得了Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557来源的内切菊粉基因inu3B,并在大肠杆菌中进行了克隆表达.为进一步提高该酶催化活力,利...     

定点突变提高过氧化氢酶热稳定性和催化效率

过氧化氢酶催化过氧化氢分解形成水和氧,主要作用是保护细胞免受活性氧(ROS)的损伤,尽管其在工业上被广泛使用,但因热稳定的不足限制了它的使用前景。本研究以Bacillus pumilus ML413来源的血红素过氧化氢酶(Kat X2)为研究对象,采用定点突变技术提高其热稳定性及催化效率。利用Po PMu Si C algorithm软件计算并预测了其潜在突变位点的折叠自由能,根据预测的结果,选择了其中自由能最低的3个位点(K117V, K117I和K117M)进行突变。结果发现,对K117位点进行突变,可以有效提高Kat X2的热稳定性,突变体K117V在60℃下半衰期比野生型Kat X2提高38 min,催化效率较突变前提高31.7%。根据结构分析发现,该点突变并未改变Kat X2的二级结构。突变体K117V具有良好的工业应用潜力。     

重组鱼腥藻脂肪氧合酶定点突变及突变酶酶学性质研究

重组鱼腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因来自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定点突变技术将Ana-LOX的421位和40位的缬氨酸（Val）突变为丙氨酸（Ala）,获得突变体V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期为3.8 min。而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为4.4 min和7.0 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min,与野生型Ana-LOX相比,提高了1.18倍。相对于野生酶,突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83%、41.58%、80.07%。突变酶的最适反应温度均比野生酶（35℃）高5℃。改造后的突变酶更能适合工业生产的需要,对于实际应用具有重要价值。      

环糊精糖基转移酶定点突变及其产物特异性分析

环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）是一种多功能酶,能够催化淀粉生成环糊精（cyclodextrin,CD）,本研究考察了Bacillus cereus的CGTase活性区域43位氨基酸与CGTase酶活力及其催化玉米淀粉形成γ-CD能力的联系。实验中共构建17 株突变株,并在大肠杆菌BL21中实现异源表达。结果表明：相比于原始酶,H43E、H43F、H43W、H43Y突变酶的活力均有所提高;产物特异性方面,除H43W突变酶外,其余突变酶的催化产物中γ-CD比例均有所升高,将43位组氨酸突变成脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸后得到的突变酶作用于玉米淀粉,酶的催化产物中β-CD含量均下降,γ-CD含量由20%分别升高到30.2%、28.4%、29.2%,实际产量由4.76 g/L升高到7.64、6.05、6.29 g/L,由此可见Bacillus cereus的CGTase活性区域中43位氨基酸对于CGTase的活力和产物特异性具有重要影响。     

A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响

利用重叠延伸法对嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶基因BD5088进行体外A154C/G155C双点定点突变,通过原核表达载体pET30a构建表达载体pET-BD5088C2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,酶学性质分析表明,突变淀粉酶拓宽了反应pH值范围,尤其是酸性条件下提高更为显著。BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min,而突变酶酶活力半衰期40min,突变酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加热60min时,突变酶酶活力仍可维持原活力的40%,而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。说明其热稳定性得到有效的提高。另外,突变酶在中温和90℃条件下酶活力有所提高,65℃时酶活力提高将近1倍。结果表明,BD5088淀粉酶的154、155位残基的突变为Cys对维持其热稳定性起到重要的作用,并且对其酶学性质有较大的影响,可能参与了二硫键的形成。     

定点突变提高食品新型L-天冬酰胺酶的活力及热稳定性

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase II,EC 3.5.1.1）可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸,减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成,因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注,但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性,对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变,并在Bacilus subtilis 168 中进行表达,提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%,突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%,突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴,提高了其在食品工业中的应用前景。     

横梗霉产酯化酶的纯化及酶学性质

在研究浓香型白酒的过程中为了提高出酒率以及优质酒率可以从酯化酶的研究入手,酯化酶对提高出酒率和产优质酒有着积极的影响。本实验从五粮液大曲中经过严格的筛选得到一株高产酯化酶的菌株横梗霉。纯化分离横梗霉酯化酶发酵液使用盐析、透析、层析等步骤得到纯化的酯化酶,纯化提高到35.66倍,且具有2.54%的活性回收率,相对分子质量约为43000 u。通过酶学性质研究得出,酯化酶作用时的最佳温度是40℃,存在热敏感特性;60℃条件下反应30 min后有67.97%酶活残留;当p H为6～8时,酶活性较佳,当p H达到7.5时,最优;使用纯化后的酯化酶进行酶学性质研究发现金属离子对酯化酶有抑制作用的是Fe~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)对酯化酶。得到结论该横梗霉所产的酯化酶有着高产、耐热性差、对热敏感、具有良好的耐碱性的性质,在使用过程中应该注意高温以及酸性环境对活性的影响。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及酶学性质表征

采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase,AK）AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明：突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型（wide type,WT）最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25 ℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示：G377F AK Vmax较WT提高9.3 倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。     

通过定点突变增强纳豆激酶的热稳定性

血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一,因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶因其特有的高效溶血栓作用,成为国内外科研热点之一。本研究针对目前纳豆激酶稳定性的问题,以纳豆激酶的晶体结构和序列比对为基础,通过定点突变构建组纳豆激酶突变体,对可能影响纳豆激酶热稳定性的氨基酸进行研究。在构建的5个突变体中,P14L、N76D两个突变体的热稳定性有明显提高,在65℃下的半衰期由20 min分别提高为30 min和50 min。同源建模和分子动力学研究结果表明,这两个氨基酸位点是通过不同机理对纳豆激酶催化活性以及热稳定性产生的重要作用。本研究可为纳豆激酶的基因工程改造以及其生产和应用提供理论基础和技术支持。     

Loop结构引入半胱氨酸对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

为了探究Loop结构引入半胱氨酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响,以溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP 1030-1木聚糖酶XynASP Loop结构为研究对象,通过定点突变技术,将第95位点天冬酰胺（Asn）突变成半胱氨酸（Cys）,获得突变体XynN95C,并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达。酶学性质分析结果表明,突变体XynN95C最适温度为50 ℃,酶活性半衰期t1/240 ℃为38 min,相比野生型XynASP分别提高了5 ℃、18 min,最适pH从6.0降至5.0。另外,XynN95C的金属离子耐受性较强,经Fe3+处理1 h,相对酶活性为93.9%,较野生型（65.9%）明显提高。由此得出,在Loop结构引入半胱氨酸可有效提高木聚糖酶的热稳定性,这为GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造又提供一新思路。     

二硫键对提高木聚糖酶AoXyn11A热稳定性的作用

为提高米曲霉11家族中温木聚糖酶Ao Xyn11A的热稳定性,将Ao Xyn11A与源于Thermomyces lanuginosus的耐热木聚糖酶Xyn A进行三维结构比对分析,发现Xyn A的α-螺旋与β9-折叠之间存在一个二硫键;基于分子动力学模拟预测结果,利用定点突变技术在Ao Xyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152),获得突变酶Ao Xyn11AT;分别将Ao Xyn11A及其突变酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化,获得重组Ao Xyn11A和Ao Xyn11AT,并分析比较温度对其酶活性的影响。结果显示,重组Ao Xyn11AT的最适温度为60℃,比重组Ao Xyn11A提高了5℃;其在50℃下的半衰期t1/250为71 min,较重组Ao Xyn11A(t1/250=25 min)提高了近2倍。研究表明二硫键对提高Ao Xyn11A的热稳定性有重要作用。