牛乳β-乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用

过敏原表位是过敏原直接参与免疫反应的物质基础, 也是导致过敏反应的“元凶”。牛乳β-乳球蛋白是lipocalin家族的代表和常用模式蛋白, 它的表位信息比较完整, 拥有7个人血清IgE和6个IgG的线性表位、3个IgE结合的构象性表位以及7个T细胞表位。另外, 它的动物源血清IgE、IgG和T细胞表位也在不断被发现。牛乳β-乳球蛋白的表位信息为基于表位的应用提供了重要的支撑, 它们的应用主要涉及到预测食物过敏原的致敏性, 食物过敏的交叉反应, 食物过敏的诊断, 食物过敏的免疫治疗以及食物过敏原的检测等5个方面。     

牛乳过敏原β-乳球蛋白核酸适配体在食品检测中的应用

食物过敏已成为全球广泛关注的食品安全问题。目前,食物过敏尚无根治疗法,避免摄入含过敏原的食物是患者的最佳选择。牛乳作为八大过敏性食物之一,建立快速灵敏的检测方法对保护牛乳过敏患者至关重要。β-乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原,可以作为检测食品中是否含牛乳蛋白的有效标志物。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术筛选获得的,能与靶标特异性结合的单链寡核苷酸。作为一种新型识别元件,核酸适配体具有易合成、易修饰、费用低、分子量小、稳定性好、亲和力高等优点,在快速高灵敏检测等方面具有广阔的应用前景。本文简要概述了核酸适配体的筛选流程与筛选方法,重点综述了β-乳球蛋白核酸适配体的筛选及其在检测方面的应用现状,并对核酸适配体技术的未来发展方向进行了展望,以期促进其在过敏原检测等领域的应用。     

水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究

为绘制水牛奶中β-乳球蛋白的过敏原表位,本实验以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机七肽库,采用间接ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性克隆。经四轮富集后,得到16个阳性克隆子,进行测序,得到5个不同的肽段。与已知的表位比对,初步确定了六个IgG识别表位,分别为:第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(EGDLEILLQKWENDE)、第81～96位(VFKIDALNE NKVLVLD)、第141～56位(KALPMHIRLSFNPTQL)、第127～136位(LNENKVLVLD)和第145～159位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。     

牛乳过敏原β-乳球蛋白检测方法的研究进展

目的食物过敏已成为全球性的食品安全问题,欧美等发达国家均要求对食品中的过敏原成分进行标识,其中就包括作为八大过敏性食物之一的牛乳及其乳制品。β-乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原,约占乳清蛋白的50%,牛乳总蛋白的10%,并且约有82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏,因此其可以作为检测食品中是否含牛乳蛋白的一个有效的标志物。建立灵敏、可靠的β-乳球蛋白检测方法,对牛乳过敏原标识及保障牛乳过敏人群的安全消费具有重要意义。本文主要综述了牛乳β-乳球蛋白的高效液相色谱法、超高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、免疫层析法、电化学免疫法、蛋白微阵列法、等离子体共振法等色谱学和免疫学检测方法的研究进展,并对未来发展方向作出展望,以期促进牛乳β-乳球蛋白等过敏原检测方法的研究与开发。     

抗水牛乳β-乳球蛋白兔lgG的亲和纯化

为得到兔血清中纯度较高的特异性抗体，通过将纯化的水牛乳β-乳球蛋白耦联到免疫亲和梓上，用3mol／L氯化镁将特异性的IgG洗脱，得到了SDS-PAGE纯的IgG，其蛋白含量为5．8mg／ml，经ELISA榆测滴度为1：109。本实验所建立的方法可用于纯化兔血清中特异性的IgG。     

抗水牛乳β-乳球蛋白兔IgG的亲和纯化

为得到兔血清中纯度较高的特异性抗体,通过将纯化的水牛乳β-乳球蛋白耦联到免疫亲和柱上,用3mol/L氯化镁将特异性的IgG洗脱,得到了SDS-PAGE纯的IgG,其蛋白含量为5.8mg/ml,经ELISA检测滴度为1:109。本实验所建立的方法可用于纯化兔血清中特异性的IgG。     

重组牛乳过敏原β-乳球蛋白的可溶性表达及其特性分析

目的 实现β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, BLG)的可溶性表达,并比较重组BLG和天然BLG在结构和免疫原性两个方面的差异性。方法 将pET-30a-BLG重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达,并对表达条件进行优化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性。利用荧光光谱和圆二色谱比较重组BLG空间结构变化,同时采用竞争抑制酶联免疫吸附实验评价重组BLG致敏性能力。结果 在Tris-HCl溶液体系中重组BLG的可溶性表达可达到50%以上,可溶性表达的最优条件为:在Tris-HCl溶液体系中,诱导温度为37℃, IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导4 h。重组BLG表面疏水性下降,可溶性重组BLG的α-螺旋结构减少,经除盐处理后致敏性下降,包涵体重组BLG无规则卷曲结构减少、致敏性上升。结论 本研究成功从上清液中纯化得到可溶性重组BLG,且可溶性表达获得的BLG空间结构更接近天然蛋白。     

食物过敏原水牛乳β-乳球蛋白的交叉反应研究

β-乳球蛋白是乳清中一种主要蛋白质,而且是乳中主要过敏原之一。本研究探讨β-乳球蛋白与其它蛋白的免疫交叉反应性。采用间接ELISA法和免疫印迹的方法,利用β-乳球蛋白和相应的多克隆抗体,检测其交叉反应。结果表明,β-乳球蛋白不仅与水牛乳中其它蛋白有交叉反应,与其他乳源的β-乳球蛋白也有交叉反应。β-乳球蛋白的交叉反应较强,也是导致乳类食物过敏的主要原因之一。      

利用β-乳球蛋白遗传变异体检测牦牛乳中的普通牛乳

建立简便、可靠的方法检测牦牛乳中添加的普通牛乳。在牦牛乳中加入5％-30％的普通牛乳，采用等电点沉淀法制备乳清，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳清蛋白。根据牦牛与普通牛β-乳球蛋白遗传变异体在电泳中的迁移率差异，可检测到牦牛乳中添加的5％的普通牛乳。该法也适用于牦牛奶粉的检测，对牦牛乳制品的质量监测有实际应用价值。     

食物过敏原水牛乳β-乳球蛋白的交叉反应研究

β-乳球蛋白是乳清中一种主要蛋白质,而且是乳中主要过敏原之一.本研究探讨β-乳球蛋白与其它蛋白的免疫交叉反应性.采用间接ELISA法和免疫印迹的方法,利用β-乳球蛋白和相应的多克隆抗体,检测其交叉反应.结果表明,β-乳球蛋白不仅与水牛乳中其它蛋白有交叉反应,与其他乳源的β-乳球蛋白也有交叉反应.β-乳球蛋白的交叉反应较强,也是导致乳类食物过敏的主要原因之一.     

牛乳中β-乳球蛋白检测方法的建立

检测牛乳中β-乳球蛋白含量可以判断牛乳热处理程度。本文利用UPLC检测速度快、灵敏度高的特点,选择210nm检测波长进行检测,建立超高效液相色谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)来测定巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳中β-乳球蛋白的含量。结果表明:采用校准曲线法定量,检测到标准工作溶液变异系数(CV)在0.04%～0.23%之间,R2=1.00;超高温灭菌乳β-乳球蛋白的平均加标回收率在97.15%～99.11%之间,变异系数(CV)在0.53%～0.71%之间;巴氏杀菌乳β-乳球蛋白的平均加标回收率在96.56%～98.43%之间,变异系数(CV)在0.04%～0.15%之间;β-乳球蛋白方法检出限为20.41 mg/kg(S/N=3),方法定量限为61.23 mg/kg,符合GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》标准要求。该方法简便易行、定量准确、精密度好,可用于液态乳中β-乳球蛋白的定量分析测定。     

聚乙二醇修饰对牛乳β-乳球蛋白抗原性的影响

通过不同修饰反应物质的量比、修饰反应时间、pH值,用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(SC-mPEG)对牛乳β-乳球蛋白(β-LG)进行修饰,研究其抗原性的变化。利用间接竞争ELISA检测结合产物的抗原性,结果显示不同条件下PEG修饰后的β-乳球蛋白的抗原性最高降低率,反应8h时为70.2%。三硝基苯磺酸(TNBS)法测定不同条件反应后样品修饰度,反应8h时最高修饰度为39.1%。结果表明修饰反应时间为SC-mPEG修饰β-LG后其抗原性降低的主要因素。     

食品中β-乳球蛋白过敏原检测方法的比较

目的 比较市场上销售的两种检测牛奶中β-乳球蛋白ELISA试剂盒效果。方法 以脱脂奶粉、β-乳球蛋白作阳性添加成分, 对两个品牌的ELISA试剂盒从回收率、精密度、特异性等方面进行比较。结果 ELISA试剂盒可以对多种食品进行β-乳球蛋白含量检测, 回收率、精密度等各项检测性能指标均可满足相关检测低限要求。结论 ELISA检测试剂盒无需大型分析仪器、操作简便快捷、适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控。     

牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的变化特性

为研究牧场牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白随季节变化规律,利用毛细管电泳法分别检测1～12月份牛乳样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量.结果表明,α-乳白蛋白含量1月份最高(1.34 mg/mL),7月份含量最低(0.68 mg/mL);β-乳球蛋白含量2月份最高(3.46 mg/mL),8月份最低位(2.15 mg/mL).说明牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量与季节气候温度负相关.     

牛乳清β-乳球蛋白过敏原非酶改性技术研究进展

牛乳乳清蛋白质中的β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin或β-LG)是婴儿牛乳过敏的主要过敏原。由于酶水解导致隐蔽于分子内部的抗原决定部位裸露,反而增强了其过敏性,并且产生影响风味的苦味肽。热处理、糖基化作用、乳酸发酵和脂肪酸结合等非酶改性技术可有效降低乳蛋白的过敏原性。热处理使蛋白质之间生成热诱导性聚合物,降低过敏性。通过糖基化作用产生糖基化终产物,掩盖抗原决定部位。乳酸菌发酵产生干酪素和蛋白酶,水解蛋白脱敏。硬脂酸与β-乳球蛋白结合以不同结合度结合,脱敏效果不同。相对来说,糖基化反应和乳酸发酵法的脱敏效果较好。为使β-乳球蛋白过敏原改性效果更好,可将两种或两种以上改性方法相结合。     

牛乳α-乳白蛋白IgE线性表位的关键氨基酸识别

α-乳白蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。识别α-乳白蛋白作用表位及影响致敏性的关键氨基酸,对于揭示α-乳白蛋白致敏机理及低致敏乳制品的开发具有重要的意义。本研究采用固相合成技术合成α-乳白蛋白系列多肽,以牛乳过敏患者血清为探针,通过酶联免疫吸附分析法识别α-乳白蛋白的作用表位和关键氨基酸。结果表明:免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)E作用表位的氨基酸序列定位为aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115。α-乳白蛋白IgE作用表位关键氨基酸为第8位的缬氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位组氨酸。本研究可以为过敏原c DNA克隆以激活T细胞、降低IgE结合能力提供重要思路。     

牛乳过敏原β-乳球蛋白分离纯化方法优化及IgG结合能力分析

目的 优化分离纯化方法,获得高纯度、高得率且具有良好IgG结合能力的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)。方法 以超速离心脱脂、等电点沉淀、硫酸铵沉淀为前处理方法,通过Sephadex G-75凝胶柱层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化β-Lg,并对纯化条件进行优化,结合SDS-PAGE与LC-MS/MS对β-Lg进行鉴定,采用Western blot对其IgG结合能力进行验证。结果 凝胶层析最佳洗脱条件为0.02 mol/L pH 6.8 Tris-HCl+0.15 mol/L NaCl,流速0.4 mL/min;阴离子交换层析最佳洗脱条件为0.05 mol/L pH 6.5 Tris-HCl+0~0.5 mol/L NaCl,流速0.5 mL/min;结合SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定,该条件下获得的终产物为β-Lg;该方法获得的β-Lg得率为54.89%,纯度为100%(SDS-PAGE),且具有良好的IgG结合能力。结论 本研究建立了一种简单、可重复的β-Lg分离纯化方法,在获得高纯度β-Lg的同时保持良好的IgG结合能力,为后续牛乳过敏及脱敏研究提供技术支撑。     

牛乳β-乳球蛋白变异体检测方法研究进展

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳中重要的天然活性营养物质,也是牛乳中主要的过敏原之一。β-乳球蛋白约为乳清蛋白总量的50%,是牛乳中主要的乳清蛋白,具有较强的热敏感性和致敏性,在优质乳品工业中起关键作用。其不仅作为牛奶热处理强度的评估指标,还作为食品中牛乳过敏原的标志蛋白,有效识别和检测牛乳β-乳球蛋白非常重要。已报道的牛乳β-乳球蛋白有13种变异体,其中A和B是牛乳β-LG的常见变异体,且含量最高。根据不同的检测原理,文章简述近年来牛乳β-乳球蛋白变异体的三大类检测方法,总结电泳法、色谱法和免疫法的原理、优缺点及部分应用实例,重点介绍液相色谱法和毛细管电泳法两种定量方法,并展望牛乳β-乳球蛋白未来的发展方向。     

纳米免疫传感器快速测定乳品中过敏原β-乳球蛋白

该研究以壳聚糖、石墨烯和纳米金为复合修饰材料固定化β-乳球蛋白抗体制备了纳米免疫传感器,建立了一种快速测定乳品中β-乳球蛋白（β-LG）过敏原的方法。用循环伏安法对该纳米免疫传感器进行了表征,以1.0 mmol/L的K3[Fe(CN)6]为探针,对试验条件进行了优化,当复合修饰液用量为5 μL,电解质pH值为7.0,抗体固载量为40 ng,孵育温度为37 ℃,孵育时间30 min时为最佳反应条件。该纳米免疫传感器免疫响应电流与β-LG质量浓度的对数在2.5~100 ng/mL之间具有良好的线性关系,其检出限为0.75 ng/mL,同时该纳米免疫传感器具有良好的稳定性、特异性与重现性。该纳米免疫传感器用于实际样品β-乳球蛋白的检测,其加标回收率位于88.59%~97.64%之间,回收率较好,检测结果比ELISA精度更高,因此该法可用于乳制品中β-乳球蛋白过敏原的快速、精确检测。     

低聚异麦芽糖糖基化法降低牛乳β-乳球蛋白抗原性

利用凝胶过滤层析法从牛乳乳清分离蛋白中分离纯化β-乳球蛋白,然后利用美拉德反应制备β-乳球蛋白与低聚异麦芽糖结合产物.通过竞争和非竞争ELISA法检测该结合产物的抗原性,结果显示糖基化后的β-乳球蛋白的抗原性得到显著降低.利用双缩脲法和苯酚硫酸法测定该结合物的组成,结果显示该结合物中β-乳球蛋白和低聚异麦芽糖摩尔比为1∶8.进而对该结合物进行凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示该结合物相对分子量为44kDa.仍保持原有二聚体结构.