响应面法优化超高压协同乳酸杀灭李斯特菌的参数

目的:研究多次超高压协同乳酸对单增李斯特菌亚致死损伤及致死的影响。方法:以单增李斯特菌为研究对象,探讨了不同压力[(0~350)MPa]、加入不同质量分数乳酸(0.05%、0.1%、0.15%)、不同加压次数[(1~4)次]对单增李斯特菌亚致死损伤和致死作用。采用单因素实验结合响应面实验,利用改良牛津琼脂(Modified Oxford Medium Base,MOX)选择性培养基和胰酪胨大豆琼脂(Trypticase Soy Agar,TSA)完全培养基进行菌落计数,得出不同条件下亚致死损伤率和灭菌率,利用亚致死损伤参数指导灭菌参数的设置。结论:单增李斯特菌菌液加入0.1%的乳酸,以250 MPa、单次5 min连续超高压处理3次时菌液的菌落数对数差值达6.32,大于350 MPa、单次10min压力处理的灭菌效果,后者灭菌对数差值仅为3.6。多次加压处理及加入乳酸均能增强灭菌效果。加压次数对细菌亚致死损伤影响不明显,低加压压力低乳酸加入量利于亚致死损伤细菌的产生。乳酸能够造成单增李斯特菌亚致死损伤,与压力协同有良好的灭菌作用。     

单核细胞增生李斯特菌对食品加工中的胁迫响应及其机制研究进展

单核细胞增生李斯特菌（简称单增李斯特菌）在食品加工过程中经常会遇到环境胁迫,如酸胁迫、热胁迫、冷胁迫、干燥和高渗透压胁迫以及交叉胁迫等,并产生应激反应,而经过环境胁迫的单增李斯特菌可显著增强其抵抗致死性环境胁迫的能力,给食品安全带来极大危害。单增李斯特菌的酸胁迫响应机制主要包括F0F1-ATPase系统、谷氨酸脱羧酶系统以及精氨酸脱亚胺酶系统。热休克蛋白、冷休克蛋白、相容性溶质在单增李斯特菌的热胁迫、冷胁迫和干燥及高渗透压胁迫反应中起重要作用。本文从以上几方面就单增李斯特菌对环境胁迫响应及其机制的研究现状进行了综述,并提出了今后可能的研究方向,为单增李斯特菌在食品加工过程中的胁迫响应研究及防控提供指导。     

食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究进展

单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）是常见的食源性致病菌,该菌可广泛存在于多种食品中,如肉制品、奶制品、水产品、蔬菜等,该菌在欧美国家曾导致多次的食物中毒的爆发,因此对食品中单增李斯特菌的快速检测非常必要,就单增李斯特菌在食品中的污染情况和检测方法作一综述。     

肽核酸荧光原位杂交技术快速检测食品中的李斯特菌属及单增李斯特菌

目的建立利用肽核酸荧光原位杂交技术(PNA-FISH)快速检测食品中李斯特菌属及单增李斯特菌的方法。方法针对李斯特菌属、单增李斯特菌分别设计合成2份PNA探针lis-16S-1、lm-16S-2,并建立荧光原位杂交技术,优化杂交条件,对选取的13株李斯特菌和其他9株非李斯特菌进行检测,验证探针的特异性和灵敏度,并对118份食品样品用LB肉汤2次增菌培养后进行PNA-FISH检测。结果探针灵敏度和特异性均为100%,从118份食品中检出14株李斯特菌和8株单增李斯特菌,结果与API方法和VITEK方法鉴定结果一致。结论 PNA-FISH方法可靠易行,对从食品中检测致病性单增李斯特菌有较高的实用性。     

免疫磁珠检测食品中单增李斯特菌的研究

免疫磁珠技术因其具有操作简便、高效快速等特点,目前已被广泛地应用于食品的快速分离纯化和检测领域中。本研究建立了单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的免疫磁珠(Immune magnetic beads)检测方法,实现对单增李斯特菌的快速检测。通过对单增李斯特菌免疫磁珠添加量、免疫磁珠与菌液最佳反应时间、免疫磁珠分离单增李斯特菌的敏感性试验、特异性试验的研究,确定了单增李斯特菌抗体添加量50μg/mL、免疫磁珠添加量100μL,免疫磁珠与菌液最佳作用时间为30min。结果表明免疫磁珠法可快速特异地检测出食品中单增李斯特菌,检测灵敏度底限为10-7,相应的细菌浓度为14cfu/mL。该方法反应灵敏度高,特异性强,大大节省了检测时间和费用,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测。因此研究食品中单增李斯特菌快速、准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生,具有重要的现实意义。     

免疫磁分离技术在食源性单增李斯特菌检测中应用的研究进展

食源性单增李斯特菌是李斯特菌属中的唯一能引起人类疾病的病原菌,致死率30%~70%,并严重威胁着人类健康。早期快速准确地检测出食品中可能污染的单增李斯特菌对于减少死亡率非常重要,因此亟需建立一些快速、灵敏和高特异性的检测方法。现有单增李斯特菌的检测方法对未经前增菌的食品样本检测灵敏度较低,限制了这些方法直接用于食品样本中单增李斯特菌的快速检测。免疫磁分离是一种可以短时间内高效富集样本中目的菌的技术,与常用的检测方法结合,可以缩短检测周期,提高检测灵敏度。本文综述了免疫磁分离技术在食源性单核细胞增生性李斯特检测中应用的研究进展。     

单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患食源性致病菌,可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、早产等疾病,危害较大。有效控制食品中的单增李斯特菌,是食品安全的重要课题之一。本文对单增李斯特菌的主要检测技术,如传统分离鉴定、免疫法、分子生物学法、全自动微生物分析系统、生物传感器检测作了简要叙述,为深入研究提供参考。并对我国单增李斯特菌的检测监控进行了展望。     

食源性单增李斯特菌检测技术研究进展

由单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)引起的李斯特菌病,被认为是世界范围内主要的食源性疾病之一,致死率可高达20%～30%。单增李斯特菌普遍存在于各类食品中,其在低温、有氧或无氧条件下、以及较宽的p H和渗透压范围内均可生长繁殖。因此,迫切需要在整个食物链条中对其进行有效监测和控制,以更好地预防食品污染和食源性疾病的爆发。食品中的单增李斯特菌是低细胞数量致病菌,且与其他非致病性李斯特菌在菌落形态、生化特性等方面具有诸多相似之处,这增加了对单增李斯特菌检测的难度。本文对传统培养方法及免疫分析法、分子生物测定法、生物传感器、噬菌体等新兴替代方法进行了系统全面综述,并比较其各自优缺点,以期为食品中单增李斯特菌的快速检测方法研究提供参考。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法

为建立食品中单核细胞增生性李斯特氏菌 (单增李斯特氏菌 )的快速、敏感、特异的PCR检测方法 ,选取hlyA基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 6 3株从国内食品中分离的李斯特氏菌 (进行传统方法验证 )和 2 0株非李斯特氏菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测 ,扩增片段表现出极好的单增李斯特氏菌种特异性 ,人工污染的生肉、冷冻虾仁、卷心菜的检出限为 39cfu g ,为食品中单增李斯特氏菌的快速、敏感并且特异的检测方法。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

Establishment of procedures provoking sub-lethal injury of Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 to serve method performance testing

In this study procedures provoking sub-lethal injury for three different pathogens are described which may be used in determination of accuracy and robustness of methods, comparison studies and or validation of rapid detection methods. Three common food-borne pathogens were used, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157. The pathogens were exposed to heat stress, cold stress, freeze stress, acid stress, oxidative stress and "food" stress. Sub-lethal injury was determined by plating in parallel on selective and non-selective media. The statistical significant differences in enumeration were established. The choice of stress to create sub-lethal injury to cells depended on the fact that the procedure must be easy to handle, repeatable and relevant for stress conditions in foods, but also on the micro-organism itself. Oxidative stress (1000 microM H(2)O(2)) was chosen to impose sub-lethal injury on L. monocytogenes and a specific "food" stress for E. coli O157. For C. jejuni a specific "food" stress as well as the oxidative stress (750 microM H(2)O(2)) were capable of creating a standardized procedure of provoking injury.     

Multi-method approach indicates no presence of sub-lethally injured Listeria monocytogenes cells after mild heat treatment

Application of mild inactivation treatments follows an increasing trend in the food industry and is often combined with sub-optimal intrinsic product conditions to ensure appropriate level of microbial safety. Listeria monocytogenes was subjected to mild heat treatment (20 min at 60 degrees C) and subsequently exposed to various mild preservation conditions based on increased NaCl concentration and decreased pH. Recovery and resuscitation of L. monocytogenes cells were studied using various methods. Using 12-fold Most Probable Number (MPN) method no difference in the amount of recovered cells under adverse conditions was noted between heat-treated and non-treated L. monocytogenes cells. Time-to-detection method using on-line OD measurements showed that heat-treated L. monocytogenes cells reached detection limit faster in acidified media and NaCl supplemented media in comparison with non-heated control cells. Flow cytometry (FCM) analysis using 5-6-carboxyfluorescein diacetate (cFDA) and propidium iodide (PI) staining showed presence of low numbers of viable cells. Overall, there was no indication of sub-lethal injury in L. monocytogenes cells after mild heat treatment.     

单增李斯特菌分子检测标记的数据挖掘

本研究采用生物信息学手段对微生物基因组进行研究,通过对单增李斯特菌和其它微生物的基因组数据的比对分析,获得了种内相似度高于99% 的未被用作检测标记的单增李斯特菌种特异性序列区段4 个和编码序列4个,较之传统的检测标记的挖掘方法更简单快捷,为建立食源性致病菌检测标记挖掘策略进行了有益的试。     

实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌

目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增（helicase-dependentisothermal DNA amplification,HDA）快速检测方法。方法：针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10 株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果：实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075 μmol/L,反应温度及反应时间为65 ℃、80 min（40 个循环）,具有良好的特异性和灵敏度。结论：建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。     

即食熟肉制品中主要致病菌的风险排序

本实验选用了3 种常用的方法--Risk Ranger、快速微生物定量风险评估（swift quantitative microbiologicalrisk assessment,sQMRA）和食品安全数据库（food safety universe database,FSUD）工具,对即食熟肉制品中的主要致病菌进行了风险排序。结果表明：即食熟肉制品中主要致病菌的风险排序从大到小依次为：单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌。相比于sQMRA模型,Risk Ranger和FSUD工具更适用于即食熟肉制品中主要致病菌的安全风险排序。     

Rapid real-time PCR detection of Listeria monocytogenes in enriched food samples based on the ssrA gene, a novel diagnostic target

A real-time PCR assay was designed to detect a 162-bp fragment of the ssrA gene in Listeria monocytogenes. The specificity of the assay for L. monocytogenes was confirmed against a panel of 6 Listeria species and 26 other bacterial species. A detection limit of 1-10 genome equivalents was determined for the assay. Application of the assay in natural and artificially contaminated culture enriched foods, including soft cheese, meat, milk, vegetables and fish, enabled detection of 1-5 CFU L. monocytogenes per 25g/ml of food sample in 30h. The performance of the assay was compared with the Roche Diagnostics 'LightCycler foodproof Listeria monocytogenes Detection Kit'. Both methods detected L. monocytogenes in all artificially contaminated retail samples (n=27) and L. monocytogenes was not detected by either system in 27 natural retail food samples. The method developed in this study has the potential to enable the specific detection of L. monocytogenes in a variety of food types in a time-frame considerably faster than current standard methods. The potential of the ssrA gene as a nucleic acid diagnostic (NAD) target has been demonstrated in L. monocytogenes. We are currently developing NAD tests based on the ssrA gene for a range of common foodborne and clinically relevant bacterial pathogens.     

荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌多重PCR检测方法的建立

针对肉制品中易污染的荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等有害微生物,通过3 种标准菌株及肉制品建立多重聚合酶链式反应方法,实现肉制品中这3 种菌的同时、快速检测。利用荧光假单胞菌的gyrB基因、沙门氏菌的invA基因和单增李斯特菌的hlyA基因设计3 对特异性引物,在确定引物特异性的基础上,对3 种标准菌株及在冷却肉上过夜富集后进行灵敏度检测。结果表明,该多重聚合酶链式反应方法对于同时检测这3 种有害微生物具有高度的特异性;同时检测这3 种菌时,纯菌DNA检测限可达1 pg/μL;将3 种菌一起接种到冷却肉中35 ℃过夜培养后,荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的检测限分别可达到9、5、70 CFU/mL。     

Impact of nitrite on detection of Listeria monocytogenes in selected ready-to-eat (RTE) meat and seafood products

ABSTRACT:  The impact of sodium nitrite (NaNO₂) on detection and recovery of Listeria monocytogenes from select ready-to-eat (RTE) foods including smoked salmon, smoked ham, beef frankfurters, and beef bologna was assessed. Nitrite-containing (NC; 100 to 200 ppm NaNO₂) or nitrite-free (NF) foods were inoculated with a 5-strain cocktail of L. monocytogenes by immersion into Butterfield's buffer solution containing 5.4 to 7.4 × 10³ L. monocytogenes per milliliter. Inoculated products were vacuum-packaged and stored at 5 °C. A weekly comparative analysis was performed for presence of L. monocytogenes using 5 detection methods on products held at 5 °C for up to 8 wk. L. monocytogenes initially present at <100 CFU/g during the first 2 wk of storage increased throughout the study, attaining final populations of approximately 1 × 10⁴ to 1 × 10⁵ CFU/g. Lactic acid bacteria predominated throughout the study in all products. Exposure to NaNO₂ (100 to 200 ppm) resulted in 83% to 99% injury to the L. monocytogenes strains tested. The genetic-based BAX^® System (DuPont™ Qualicon, Wilmington, Del., U.S.A.) and modified USDA/FSIS methods detected 98% to 100% of Listeria -positive food samples and were consistently superior to and significantly different ( P < 0.05) from conventional cultural methods in recovering Listeria from NC samples. Data show that nitrite-induced injury adversely affects detection and recovery of L. monocytogenes from NC food, confirming earlier findings that nitrite-induced injury masks L. monocytogenes detection in NC RTE food products. Nitrite-injured Listeria can subsequently repair upon nitrite depletion and grow to high levels over extended refrigerated storage.     

酱卤肉中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌生长特性及预测模型建立

依据流行病学的调查结果,酱卤肉中检出率较高的致病菌为沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。本实验对该两种代表性致病菌以酱卤肉作为培养基成分在不同温度下的生长特性进行研究,建立了不同温度下沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的生长一级模型和二级模型。在沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌培养温度范围内得出酱卤肉制品中沙门氏菌的动力学模型为：lgN＝A＋（10.2－A）×exp{－exp[e×（－3.173 1T2＋2.02T＋1.812）×（1.252T2－7.746T＋1.22－t）/（10.2－A）＋1]};酱卤肉中单核细胞增生李斯特菌的动力学模型为：lgN＝A＋（17.9－A）×exp{－exp[e×（－9.024T2＋5.774T－4.402）×（1.378T2－7.995T＋1.172－t）/（17.9－A）＋1]}。运用该预测模型可描述自然状态下酱卤肉制品中的两种代表性致病菌数量的动态变化,为该类产品的生产、运输、贮藏及销售过程中的食品安全保证提供良好的理论依据,用以减少由致病菌引发的食品安全风险,并为建立酱卤肉企业的食品安全管理体系提供科学基础。