利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达。然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白。蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性。同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论。     

人硒蛋白SelK在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP.方法:利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上,通过酶切、序列测定进行鉴定.通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达,并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间.结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白,占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达.结论:成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒,为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制各打下了基础.     

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG－1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性,使用PCR的方法扩增人HRG－1基因ORF的编码序列,构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定,实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG－1原核表达蛋白,且人HRG－1原核表达蛋白具有真核表达蛋白一致的生物学活性。     

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

离子强度对于牛精蛋白在大肠杆菌中的表达的影响

通过基因合成将大肠杆菌偏好的精氨酸密码子CGT取代野生型牛精蛋白基因中的稀有精氨酸密码子AGA和AGG，得到密码子优化的牛精蛋白基因，并将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，可得到一33kD融合蛋白表达带，首次成功地将牛精蛋白在大肠杆菌中进行了表达，但其表达量很低，约为总菌体蛋白的13％。增加表遂菌株培养液的离子强度，可将蛋白表达含量提高到28％，且蛋白表达量与离子强度呈正相关。纯化后的牛精蛋白可在体外条件下与DNA发生结合。     

八肋游仆虫γ微管蛋白cDNA序列及其在大肠杆菌中的表达

提取八肋游仆虫（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ ｏｃｔｏｃａｒｉｎａｔｕｓ）的ｍＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术对其γ微管蛋白基因的ｃＤＮＡ序列进行了分析。结果表明八肋游仆虫的微管蛋白编码基因至少使用４个转录起始位点,分别位于起始密码子前的３２、２９、２４和２０ｂｐ处;该基因同时也有至少４多聚腺苷酸加尾位点,分别位于终止密码子后的２１、２３、２９和３２ｂｐ处。由于多个转录起始位点和多聚腺苷酸加尾位点的存在。对应的ｍ     

植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价，建立一种简便、高效的体外微生物表达体系，以获得大量的HPT蛋白，将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上，在E．coli BL21中进行诱导表达，所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在，且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件，成功地获得了可溶性的融合蛋白，该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析，所得蛋白纯度＞95％。动物实验显示，融合蛋白还具有良好的免疫原性，免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(＞1：10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行HPT蛋白的安全性评价打下了良好的基础。     

中国明对虾蜕皮抑制激素在大肠杆菌中的表达与分离纯化

采用大肠杆菌表达系统对中国明对虾蜕皮抑制激素(MIH)进行了体外重组表达研究.重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.尿素-SDS-PAGE分析表明,经1mmol/L的IPTG诱导4h后,重组蛋白获得了大量表达,在分子量为13 kD处有一条与预测大小一致的特异性蛋白条带;经金属螯合柱纯化后,得到了电泳纯的融合蛋白.Western blotting检测结果表明:重组表达的融合蛋白与兔抗刀额新对虾MIH的多克隆抗体特异结合,证实该融合蛋白为中国明对虾MIH.通过胶内酶切与LC-ESI-MS分析进一步证实融合蛋白的部分肽段与日本对虾MIH一致.MIH融合蛋白的成功表达为进一步深入研究其在中国明对虾蜕皮过程分子作用机制奠定了基础.     

cpcB与CT融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将人和鲑鱼嵌合型降钙素基因与藻蓝蛋白的β亚基基因相连,插入融合表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21。融合蛋白cpcB-CT基因在IPTG诱导下获得高效表达。超声破碎后,经SDS-PAGE分析,在48kD处有新增条,灰度扫描测定,过表达蛋白量占50％～60％,85％为包涵体。包涵体经变性、复性,过Glutathion-Sepharose-4B亲和吸附柱,获含有GST。的融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化和截留分离,获得纯化的融合蛋白cpcBCT。Western blotting分析表明,产物具有与合成人降钙素相似的抗原决定簇部分;ELISA-受体法和大鼠降血钙试验表明,其具有降血钙作用。提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景。     

大腹园蛛牵引丝在纺丝过程中的分子构象

利用圆二色光谱测定大腹园蛛的丝蛋白，结果显示蜘蛛丝溶液中的构象最初是无规卷曲和β折叠，同时用拉曼光谱对蜘蛛吐丝口附近的牵引丝及垂直下落的蜘蛛牵引丝进行比较，结果表明在蜘蛛纺丝过程中无规卷曲转变为α螺旋，并且垂直下落的蜘蛛牵引丝由于受到空气中的拉伸其β折叠取向比吐丝口附近的牵引丝好。这些分子结构的多样性决定了蜘蛛牵引丝优异的机械性能。     

丝素在离子液体中的溶解及再生丝素纤维的结构

以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[BMIM]Cl）为溶剂,研究了丝素蛋白在[BMIM]Cl中的溶解情况,结果表明,温度对丝素在[BMIM]Cl中的溶解有较大影响,当温度〈90℃时,即使延长溶解时间,丝素也难以溶解,而当温度≥90℃时,随着温度升高,溶解速率明显加快。考虑到高温会使丝素降解,因此,选择100℃为丝素...     

傅里叶红外光谱研究重组蛛丝蛋白分子构象的影响因素

利用FT-IR研究重组蛛丝蛋白pNSR16在各种影响因素中构象的变化,结果表明,溶剂对pNSR16构象的影响取决于溶剂的种类,甲酸使其构象进一步向无规卷曲方向转变,而饱和溴化锂溶液则使其构象向β-折叠方向转变;加热和变性能促使pNSR16构象向β-折叠方向转变;PVA、CS的加入使pNSR16构象从无规卷曲向β-折叠转化。这些结论可从分子水平上指导重组蛛丝蛋白组织工程复合材料的制备。     

丝素蛋白水凝胶材料在组织工程中的应用研究进展

组织工程技术是有望从根本上解决组织或器官损伤及实现功能重建的前沿技术,其关键之一是制备具有良好生物相容性和生物降解性的支架材料。水凝胶由于具有众多良好的特性,成为组织工程研究中一种优良的支架材料。丝素蛋白水凝胶由于独特的性质、多样化的成胶方式以及优异的可加工性成为了支架材料研究的热点,备受学者的青睐并涌现出了大量的研究成果。本文在阐明丝素蛋白凝胶原理的基础上,回顾了目前较为成熟的凝胶化方法,随后重点综述了丝素蛋白水凝胶在组织工程中的研究进展,最后进行了总结和展望,以期为相关领域的研究者提供参考和借鉴。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

BMP－3和5在不同组织、细胞中的检测及其在大肠杆菌中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，检测了ＢＭＰ－３及ＢＭＰ－５在不同组织中的表达，并将ＰＣＲ扩增出的ｂｍｐ－３和ｂｍｐ－５ｃＤＮＡ克隆入ｐＧＥＸ表达载体．在大肠杆菌中得到高效表达。