特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化

应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。     

重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。     

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。     

采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达

胰蛋白酶是一种重要的工业酶,广泛应用于皮革加工、食品加工和医药等领域。该研究从菌株改造及发酵条件优化两方面提高了灰色链霉菌胰蛋白酶(Streptomyces griseus trypsin, SGT)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的发酵产量。首先,分析了4种分子伴侣(Cne1、Bmh2、Ssa4和Vhb)和2种转录因子(Yap1、Aft1)对SGT在P.pastoris GS115中表达的影响。摇瓶发酵结果显示,与转录因子Aft1共表达时SGT酶活力较对照菌提高了19.71%,达到217.30 U/mL;其他转录因子或分子伴侣的共表达降低了SGT产量。其次,确定了菌株PP-SGTm/Aft1的最适生长pH和最适诱导pH分别为5.5和6.5。最后,优化了PP-SGTm/Aft1在5 L罐中诱导产酶过程中流加混合碳源(甲醇-山梨醇)的比例。结果显示,当补加的m(甲醇)∶m(山梨醇)=20∶0.5时,5 L罐SGT酶活力达到了2 667.24 U/mL(144 h),较仅流加甲醇酶活力提高了20.1%。研究结果将为SGT工业化发酵生产提供重要基础数据。     

Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

在已获得Spinigerin α抗菌肽摇瓶发酵条件的基础上,对其在50 L发酵罐中的初始甘油质量浓度、补料方式、甲醇与山梨醇混合比例、诱导温度、诱导pH值和诱导时间进行优化,并对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值进行正交试验。结果表明：甘油初始质量浓度10 g/L、补料方式为变速补料、甲醇与山梨醇混合体积比1∶1、诱导时间96 h、诱导温度24 ℃、诱导pH 5.0。在此最佳发酵条件下,50 L发酵罐的Spinigerin α抗菌肽产量较摇瓶条件提高20%。     

重组果聚糖蔗糖酶的发酵优化及应用

为了研究不同条件下重组短小芽孢杆菌产果聚糖蔗糖酶的最适条件以及利用重组酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖的最适转化条件。以前期构建的产果聚糖蔗糖酶重组短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis/pNCMO2-lsc作为菌种,通过单因素试验以及正交试验确定其最适产酶的发酵培养基为:葡萄糖20 g/L、氮源(工业酵母粉∶棉籽粉=2∶1,质量比)为40 g/L、CaCl_20.5 mmol/L,最适产酶温度30℃。在最优条件下发酵培养,果聚糖蔗糖酶的酶活可达62.1 U/mL,是优化前的3.69倍。利用该重组果聚糖蔗糖酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖,在蔗糖和乳糖质量浓度均为200 g/L情况下,确定其最适转化条件:反应温度35℃,pH 6.0,加酶量为2 U/g底物,反应8 h后低聚乳果糖转化率可达39.1%。     

两阶段温度控制策略以及助剂促进淀粉分支酶的胞外表达

为了促进重组淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)中的胞外表达,对重组淀粉分支酶在摇瓶水平上进行了发酵优化。首先,以胞外酶活力为指标,先后考察了初始培养基、p H、培养温度和培养时间4种因素对胞外表达的影响;然后,通过两阶段温度策略和助剂的添加进一步提高胞外表达水平。结果表明,当发酵培养基为TB、p H为7.5时,25℃培养24 h后胞外酶活力达到19.9 U/m L;同时,菌体生长最适温度和酶分泌的最适温度是不一致的,通过两阶段温度控制策略(即0~12 h控制温度30℃,12 h后温度调至25℃),胞外酶活力与单一温度条件下的最高水平(25℃)相比提高了1.4倍,达到了47.1 U/m L;在此基础上,进一步添加0.05%的吐温-80,将胞外酶活进一步提高40%,达到65.8 U/m L。     

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶表达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件。结果表明,在50 mL培养基中,菌体浓度为OD600=0.6时,用0.5 mmol/L的IPTG,在温度为20℃,转速为120 r/min的条件下,诱导12 h后,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33 U/mL,是优化前的1.66倍。酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38℃,最适pH为8.0,最适离子是12 mmol/L Mn2+,最适表面活性剂是1.0%Trition X-100。在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%。     

渗透压诱导表达重组Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因

以热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes基因组为模板,PCR扩增出β-淀粉酶基因;将该基因克隆到pET-22b(+)载体上,转入大肠杆菌BL21-SI,采用NaCl形成的高渗透压诱导表达。研究了不同诱导条件对重组菌产β-淀粉酶的影响,结果以菌体密度达到OD600为0.6,诱导剂NaCl浓度为0.6 mol/L,诱导温度为35℃最佳。重组菌以LBON为培养基分批发酵时,由于营养限制,菌体密度OD600仅为4.60,β-淀粉酶活力为118U/mL。采用pH-Stat分批补料发酵时,在菌体密度仅是分批发酵的2.35倍的条件下,得到6.12倍的产酶量,酶活力达722U/mL。重组β-淀粉酶70℃水解可溶性淀粉3h的麦芽糖转化率为62.2%,高于大麦β-淀粉酶的转化率。     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

马克斯克鲁维酵母木薯乙醇发酵工艺研究

通过单因素试验对一株耐高温马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32的木薯乙醇发酵工艺进行了研究。结果表明,HY32利用木薯发酵乙醇的最佳工艺条件为料水比1∶5（g∶mL）,发酵时间96 h,接种量11%,发酵温度40 ℃,液化时间1 h,液化温度95 ℃,液化酶添加量为20 U/g淀粉,糖化酶添加量为150 U/g淀粉,硫酸铵添加量6 g/L,初始pH=5.0。在此条件下,HY32发酵木薯酒精度可达8.90%vol,淀粉利用率与淀粉出酒率分别为87.120%和49.48%,残糖量为0.03 g/L。与未优化的初始发酵条件相比,发酵醪的酒精度提高了16.65%。     

黑曲霉产胺氧化酶培养及诱导条件的优化

黑曲霉可经诱导产生胺氧化酶,该酶具有催化生物胺氧化脱氨生成相应醛、氨气和过氧化氢的特性。黑曲霉胺氧化酶产生分菌体生长和诱导产酶两个阶段。通过单因素试验优化得出黑曲霉产胺氧化酶的菌体生长最佳培养条件：氮源为NaNO3,碳源为麦芽糖,接种量1%,培养时间24 h;诱导产酶的最佳培养条件：诱导氮源为质量浓度60 g/L的正己胺,诱导碳源为葡萄糖,培养时间36 h,培养温度30 ℃,摇床转速160 r/min,初始pH 7.0,胺氧化酶酶活力从诱导前的1 006.5 U/g提升至1 422.4U/g,提高幅度为41.3%。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

复合酶法结合液相色谱技术测定山药酒中薯蓣皂苷的含量

对复合酶法结合高效液相色谱（HPLC）测定山药酒中薯蓣皂苷的方法进行优化,通过单因素和正交试验确定酶法提取优化条件为采用复合酶（纤维素酶∶淀粉酶为1∶1）对山药酒进行酶解,复合酶用量为2 U/mL,酶解时间为12 h,酶解温度为40 ℃,酶解初始pH值为5.0。高效液相色谱法最优检测条件为采用Inertsil■ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相为乙腈-水（50∶50,V/V）;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长203 nm。采用该方法对市售山药酒进行测定,薯蓣皂苷含量为0.106～1.156 mg/L,不同品牌产品含量水平存在差异。     

重组环糊精葡萄糖基转移酶温控型工程菌的构建及其培养条件的优化

采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法从蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中扩增了β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-cyclodextrin glucanotransferase,β-CGTase）基因,将该基因克隆到pBV220质粒中,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选和酶切验证后,得到能表达β-CGTase的重组大肠杆菌E.coliDH5α/pBVcgt。通过对工程菌产酶条件的优化,得到最佳产酶条件为：OD600 nm值达到1.0、初始培养温度30 ℃、发酵培养基初始pH 8.0、温度梯度诱导39 ℃培养0.5 h,40 ℃培养0.5 h,41 ℃培养1 h,42 ℃培养2 h。酶活力由优化前的445 U/mL提高到956 U/mL,酶活力提高了1.15 倍。温度梯度诱导比直接诱导酶活力提高20%。该酶的克隆表达以及发酵条件的研究表明,该酶能在大肠杆菌原核表达体系中高效表达。     

嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶培养基及发酵条件优化

以嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM1.208为研究对象,通过单因素、正交试验和响应面法优化其产β-葡萄糖苷酶的培养基及发酵条件。结果表明,嗜酸乳杆菌GIM1.208发酵产β-葡萄糖苷酶的最佳产酶条件为葡萄糖添加量3.0%,羧甲基纤维素钠添加量0.4%,初始pH值5.5,料液比1∶4（g∶mL）、发酵温度31 ℃,发酵时间24 h,接种量2.6%。在此优化条件下,β-葡萄糖苷酶活力为16.80 U/mL,是优化前的3.90倍。     

甘草提取液对大肠杆菌O157∶H7抑菌作用及豆腐干的保鲜研究

研究了甘草提取液对豆腐干中大肠杆菌(E.coli)O157∶H7的抑菌作用以及对豆腐干在10℃下的贮藏保鲜作用。根据响应面法优化的最佳工艺条件得到甘草提取液,用于大肠杆菌O157∶H7的抑菌研究,通过理化指标和感官评价研究对豆腐干的保鲜作用。结果表明提取的最佳条件为提取温度77.80℃,提取时间7.58 h,料液比1∶9.61(g/mL),5%甘草提取液使大肠杆菌O157∶H7在豆腐干中的停滞期达5.8 d,同时能延缓豆腐干的pH值和可滴定酸度、失水率、感官品质等变化。甘草提取液对大肠杆菌O157∶H7有较好的抑制作用,对豆腐干有一定的保鲜作用。     

罗布麻酶法脱胶初探

为探索罗布麻酶法脱胶的最优工艺条件,采用筛选的新型罗布麻脱胶菌种——琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii FM208850),在单因素实验基础上,运用Box-Behnken设计的响应面试验方法对酶法脱胶工艺进行了预测。根据回归分析确定了最优工艺:添加质量分数0.2%Na2CO3使沤麻液初始pH值为9.5,酶量8.38 mL(161.3 U/mL),质量体积比1 g∶16 mL,脱胶温度45℃,脱胶时间10 h;此工艺下测得残胶率为7.937%。与回归模型预测残胶率相差不大,模型与实际情况拟合较好。     

植物乳杆菌发酵紫薯饮料的研制

以紫薯为原料,利用植物乳杆菌为发酵剂,对紫薯乳酸发酵饮料的加工工艺进行研究。结果表明:紫薯用5倍水打浆,加入6U/100m L薯浆α-淀粉酶于60℃条件下酶解20min,再添加55U/100m L薯浆的糖化酶在p H4.5条件下糖化90min,可得理想的淀粉水解效果。通过正交实验,确定产品的最佳发酵工艺条件为接种量4%,发酵温度37℃,发酵时间14h;实验最佳配方为蔗糖8%,柠檬酸0.1%,黄原胶0.02%,CMC-Na 0.02%,PGA 0.02%。      

响应曲面法优化酶解豆粕蛋白制备降糖肽的工艺

采用响应曲面法(Response Surface Methodology,RSM)对豆粕蛋白酶解制备降糖肽的工艺进行优化。在单因素实验基础上,选择初始pH、酶解温度和酶解时间,进行三因素三水平的Box-Behnken实验设计,采用响应曲面法分析3个因素对酶解产物抑制活性响应值的影响。结果表明,最佳工艺条件为初始pH9.5,酶解温度49.0 ℃,酶解时间5.5 h,料液比1:20(w:v),加酶量2%(w:w)。此条件下,酶解产物的α-葡萄糖苷酶的实际抑制率为14.82%±0.23%,而预测抑制率为14.80%。研究结果为豆粕资源的开发提供了新的思路。