榆干离褶伞溶栓酶的纯化及酶学性质研究

采用离子交换层析、凝胶过滤层析及快速蛋白液相色谱等蛋白质分离纯化技术,从榆干离褶伞菌丝体中纯化一种溶栓酶,并探讨各种因子对榆干离褶伞溶栓酶活性的影响,观察溶栓酶对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解特征和酰胺水解活性。实验结果表明,其分子质量约为50 ku,该酶的最适pH和最适温度为pH 6.0,35℃,并对tPA底物S-2288最敏感。Mn~(2+)和Mg~(2+)激活酶活性,而Cu~(2+),EDTA对酶活有抑制作用。该酶不仅直接水解纤维蛋白,还可以水解纤维蛋白原。榆干离褶伞很有潜力成为治疗血栓的新的药物来源。     

揄干离褶伞菌丝体溶栓酶特性研究

探讨各种因子对榆干离褶伞溶栓酶活性的影响,观察溶栓酶对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解特征和酰胺水解活性.实验结果表明,该酶的最适pH为6,最适温度为35℃,并对tPA底物S-2288最敏感.Mn2 和Mg2 激活酶活性,而Cu2 、EDTA对酶活有抑制作用.该酶不仅直接水解纤维蛋白,还可以水解纤维蛋白原.因此,榆干离褶伞溶栓酶很有可能成为治疗和预防血栓栓塞性疾病的新来源.     

欧文氏菌乳糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

对欧文氏菌Erwinia sp.E5株所产β-半乳糖苷酶进行分离纯化,所得纯酶的比酶活为554.92U/mg.蛋白质。对纯化得到的酶进行酶学性质研究,其最适反应温度为40℃,在20℃保持40%以上的酶活力;该酶最适反应pH为7.0,在pH 6.5体系中保持95%的酶活力;Mg2+和Na+对该酶具有激活作用,而Ca2+为弱抑制剂。乳糖水解试验显示该酶在乳糖含量小于10%的反应体系中具有较高反应速率。     

绿色木霉产壳聚糖酶的分离纯化及酶学性质

对绿色木霉所产的壳聚糖酶进行分离纯化,结果表明当壳聚糖酶经过20%和60%的硫酸铵分级沉淀、透析、超滤浓缩、苯乙烯系阴离子交换柱以及Sephdex G-75层析柱的分离纯化,发现该酶的纯化倍数达到29.13倍,回收率达到53.9%,经SDS-PAGE电泳鉴定该酶达到了电泳纯,其分子质量为51.235 ku,最适温度为50℃,最适pH值为5.2,具有较强的底物特异性,K+和Mn2+对酶有一定的激活作用,Mg2+、Fe3+、Ca2+和Pb2+的影响不明显,Zn2+、Cu2+和Hg2+对酶有较强的抑制作用.通过Lineweaver-Burk法求得动力学参数,该酶Km值为0.048 mg/mL,Vmax值为0.6 mg·L-1·min-1.据酶解产物薄层层析实验分析其水解产物,说明此酶主要以内切方式作用于壳聚糖,该酶既能水解GclN-GlcN糖苷键,也能水解GlcNAc-GlcN糖苷键.     

高活性大豆异黄酮糖苷酶的分离原料筛选、纯化及性质研究

通过对32种植物β-葡萄糖苷酶水解染料木苷的活性比较,发现鹰嘴豆β-葡萄糖苷酶具有4.19U/mg的大豆异黄酮糖苷水解酶活性.该酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose-52离子交换、Sephadex G-100凝胶层析纯化,纯化了10.1倍,收率为7.2%;SDS-PAGE和Sephadex G-100凝胶层析结果表明,该酶的分子量为73.2kD,含两个亚基;该酶的最适反应温度为45℃;最适pH6.0;当以染料木苷和大豆苷为底物时该酶的米氏常数分别为11.0和19.0μg/ml.温度在30～45℃、pH值在4.5～6.5范围内该酶较稳定;Ag+、Hg2+和D-葡萄糖酸内酯对该酶有强烈抑制作用.该酶能水解染料木苷和大豆苷,但不能水解纤维二糖和α-乳糖.     

Bacillus sp.CBB272脱枝酶的酶学性质

脱枝酶是淀粉加工过程中水解其1,6-糖苷键的水解酶,为淀粉彻底糖化所必需。作者从高温菌Bacillus sp.CBB272的培养液中,经过盐析、凝胶过滤层析、弱阴离子交换层析以及强阴离子交换层析联用的方法,纯化出一种新型脱枝酶。该酶在SDS-PAGE上的相对分子质量约为70 000,最适作用温度为70℃,最适作用pH为6.0。该酶在30~70℃、pH 4.5~9.0之间具有优良的稳定性。该酶在50℃和pH 6.0下水解支链淀粉的Km、Vmax分别为4.0324 mg/mL和0.1841 mg/(min.mL)。研究了不同金属离子对该酶活性和热稳定性的影响,发现Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对于该酶具有显著的激活效果,并且Ca2+对该酶的热稳定性具有很好的提升作用。     

Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1几丁质酶的性质及在虾皮水解中的作用

以一株产几丁质酶细菌Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1为材料,对几丁质酶进行了分离纯化及酶学性质研究。通过硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose阴离子交换介质和SephadexG-100分子筛层析柱处理其所产几丁质酶,获取纯度为95%以上的几丁质酶。酶学性质表明,该酶的最适温度为40℃,最适pH值为6.5,在50℃以下较为稳定,在pH值为5.0时最稳定,β-巯基乙醇有利于防止半胱氨酸氧化而增加几丁质酶稳定性,EDTA可增加该酶稳定性,Na+,K+对几丁质酶有明显的激活作用,Zn2+,Mn2+,Fe2+,Fe3+对几丁质酶有较大的抑制作用。SYBC-H1几丁质酶可把虾皮水解为N-乙酰氨基葡萄糖,水解率为21.8%。     

低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质

苏云金芽胞杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其相对分子质量约40 000。对纯化后的脂肪酶进行酶性质研究表明:酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30 min仅残留30%酶活性;酶的适宜作用pH范围在7～9,最适pH为8;该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现明显的依赖性,Al3+、Zn2+和Fe2+对脂肪酶有显著的抑制作用;脂肪酶对醇类有机溶剂的耐受性随碳链增加而减小;脂肪酶对豆油表现出显著的特异性,而蓖麻油抑制脂肪酶水解活力。     

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。     

鸭肝丁酰胆碱酯酶的纯化与酶学性质研究

目的:获得鸭肝丁酰胆碱酯酶纯品并对其酶学性质进行研究。方法:采用丙酮脱脂、酸沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶层析方法,分离纯化鸭肝丁酰胆碱酯酶;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶相对分子量测定。结果:从鸭肝中分离纯化获得电泳纯的丁酰胆碱酯酶,纯化倍数为156.45倍,酶活回收率为23.60%,比活达17.21U/mg。酶相对分子量为388.85kDa,亚基相对分子量为64.70kDa。推测该酶由六个相同亚基构成。该酶最大紫外吸收为278nm。酶催化碘化硫代丁酰胆碱水解的最适pH为8.0,最适温度为35℃。该酶在pH3.0～10.0区域较稳定;在40℃以下处理1h,酶活力保持稳定。Zn2+、Mn2+和Cu2+对该酶具有显著的抑制作用。以碘化丁酰硫代胆碱为底物,测定该酶的表观Km为71.15μmol/L,没有过量底物抑制现象。结论:成功分离纯化获得丁酰胆碱酯酶,该酶具有较好的酸碱耐受性。     

榆干离褶伞菌丝体中溶栓酶的分离纯化

采用离子交换层析、凝胶过滤层析及快速蛋白液相色谱等蛋白质分离纯化技术,从榆干离褶伞菌丝体中分离纯化了一种溶栓酶。实验结果表明,其分子量约为50ku,比活性为750.6Unit/mg,活性得率为12.5%。榆干离褶伞很有潜力成为治疗血栓的新的药物来源。     

解淀粉芽孢杆菌产纤溶酶的19 L发酵罐实验及其酶学性质

在摇瓶实验的基础上,对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7产纤溶酶最佳条件进行19 L发酵罐实验,结果表明：GZJSI-12-7在发酵罐中培养6 h时开始产纤溶酶,78 h后纤溶酶产量基本稳定,达到4 178.39 IU/mL,产酶高峰比摇瓶发酵提前12 h左右。将发酵液经离心除菌、硫酸铵分级盐析、透析除盐、SephadexG-75凝胶过滤,得到纤溶酶的纯化倍数为9.84 倍,酶活力回收率为42.52%,比活力为48 073.193 IU/mg。对纤溶酶的酶学性质研究表明,该酶的分子质量约为30.2 kD,最适温度和pH值分别为40 ℃、7.5;在40 ℃以下酶的稳定性良好,超过50 ℃后酶活力迅速降低,耐热性较差;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+对纤溶酶活性均有较强的激活作用,而Cu2+和Fe3+对酶活性具有明显的抑制作用。     

蛹虫草纤溶酶酶学性质的初步研究

采用盐析和离子交换层析法制备蛹虫草纤溶酶粗酶样品,并对其酶学性质进行初步研究。结果显示：该酶最适pH 值和作用温度分别为8.0 和37℃; 在pH6～10.6 范围内较稳定,但对高温较为敏感;EDTA 对蛹虫草纤溶酶具有抑制作用,说明该酶是一种基质金属蛋白酶;金属离子Ca2+、Fe2+ 在低浓度(0.01mmol/L)时对此酶有促进作用,但高浓度时有抑制作用,而NH4+对酶活性影响不大。     

淡豆豉纤溶酶的分离纯化

淡豆豉浸提液经过硫酸铵沉淀、CM-Sepharose-FF离子交换色谱和Sephacryl S-200凝胶过滤等步骤，得到豆豉纤溶酶，经SDS-PAGE表明豆豉纤溶酶为单一谱带。推断DCFE没有亚基，以单体形式存在。经过纯化，豆豉纤溶酶的回收率为3．7％，纯化倍数35．5倍，比活达到10898IU／mg。SDS-PAGE凝胶电泳和Sephacryl S-200凝胶过滤测定的DCFE相对分子质量分别为30．2kDa和31．OkDa，两种方法测定的分子量相近，说明该酶为单体酶。     

内生多黏类芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其体外溶栓作用

植物内生菌株 EJS-3 发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenyl FF 疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR 凝胶过滤,获得电泳纯的多黏芽孢杆菌纤溶酶(PPFE-I),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量为63kD,高效液相色谱法(HPLC)鉴定其纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6mg 活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096IU,纯度提高了14.5 倍,回收率为3.3%。纯化后的纤溶酶PPFE-I 具有明显的体外溶栓作用。     

Bacillus sp.nov SK006中纤维蛋白溶解酶的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术从Bacillus sp.nov SK006中扩增得到纤维蛋白溶解酶(Fibrinolitic enzymes,FE)基因的DNA片段,将其连接到pMD-T载体上,经测序后克隆至载体PET-22b(+),转化至E.coli BL21(DE3)中,得到的重组菌能高效表达FE。诱导表达后,SDS-PAGE显示,重组FE分子量约为28 ku。     

少根根霉发酵液纤溶酶的分离纯化及部分性质鉴定

以产纤溶酶的根霉菌8B进行发酵,发酵液通过蒸发浓缩、(NH_4)_2SO_4分级沉淀、透析除盐、DEAE阴离子交换纤维素层析、Sephadex G—75凝胶过滤层析对该酶进行纯化,纯化浓缩后酶液活力达到3 978.5U/ mL。结果表明,该纤溶酶在-18～37℃,pH 5～7时性质稳定。该酶即能直接分解纤维蛋白,又能激活血纤维蛋白溶酶原,间接分解纤维蛋白。对家兔血栓的溶解实验表明,8B纤溶酶6h对血栓的溶解率达到52.4%,并且对兔血细胞没有明显损伤,在体外是安全有效的。     

平菇菌丝体多糖的分离纯化和体外抗氧化活性

采用酶法提取平菇菌丝体多糖,通过L9(34)正交试验考察加酶量、温度、时间、pH 值对平菇菌丝体多糖提取率的影响,确定其最佳提取条件;通过DEAE-32 离子交换层析和Sephadex G100 凝胶过滤纯化平菇菌丝体多糖,DPPH 自由基清除作用测定抗氧化活性,紫外光谱扫描和薄膜电泳方法鉴定多糖的纯度;利用化学比色法检测其对O2－·和·OH 的清除能力和对小鼠红细胞溶血抑制程度。结果表明：平菇菌丝体多糖最佳提取条件为加酶量1.0%、温度55℃、时间2h、pH5.3,最佳条件下多糖提取率为(4.91 ± 0.15)%;纯化后的多糖能清除O2－·和·OH 及抑制红细胞溶血的生成,且呈现一定剂量关系。表明平菇菌丝体多糖在一定浓度范围内具有体外抗氧化作用。     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。