球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

酿酒酵母原生质体菌株的筛选

实验研究酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) 原生质体的分离再生及再生菌株的构建 ,以蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的去壁效果最好 ,而新生酶、几丁质酶的去壁效果较差。 2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液浓度在 0 .1 %～ 2 %内原生质体释放量随酶解液的浓度升高而上升。酶解液 pH值在 5 .0～ 7.0时原生质体的产量较高 ,渗透压稳定剂以柠檬酸 -磷酸缓冲液( pH6.0 ,内含 0 .8mol/L山梨糖醇 )处理原生质体释放量最高。而培养基对原生质体释放量的影响不明显。通过原生质体融合技术 ,获得融合子HG112 ,对HG112 进行以葡萄糖为基质的发酵试验 ,结果显示该融合子乙醇含量达 7.9% (体积比 ) ,比亲本QT提高 4 9.7% ,该技术可用于筛选优良菌株     

酿酒酵母原生质体菌株的筛选

实验研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）原生质体的分离再生及再生菌株的构建，以蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的去壁效果最好，而新生酶、几丁质酶的去壁效果较差。2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液浓度在0.1％－2％内原生质体释放量随酶解液的浓度升高而上升。酶解液pH值在5.0－7.0时原生质体的产量较高，渗透压稳定剂以柠檬酸－磷酸缓冲液（pH6.0，内含0.8mol/L山梨糖醇）处理原生质体释放量最高。而培养基对原生质体释放量的影响不明显。通过原生质体融合技术，获得融合子HG112，对HG112进行以葡萄糖为基质的发酵试验，结果显示该融合子乙醇含量达7.9％（体积比），比亲本QT提高49.7％，该技术可用于筛选优良菌株。     

响应面法优化微波提取酿酒酵母中谷胱甘肽条件的研究

利用响应分析法考察了微波处理时间、提取时间和水料比3个因素对微波提取酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取率的影响。研究发现,谷胱甘肽的最佳提取条件为:微波处理20.96 s、提取时间为13.25 min,加水量与干细胞的比为22.20 mL/g,谷胱甘肽的提取率为13.06 mg/g,比单因素试验最高的提取率高8.3%,且与预期值相符。     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉eDNA文库中筛选出糖化酶基因,并在酿酒酵母中进行表达．阳性克隆在发酵培养基中培养60h后,产生的糖化酶酶活力达到峰值为4．3U／mL．测定结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质．酶学性质分析显示该酶的最适反应温度为50℃,pH为5．0．经柱分离纯化其发酵上清液后,SDS-PAGE电泳方法,测得它的分子量大约为70kD,且条带清晰．     

响应面法优化微波提取酿酒酵母中谷胱甘肽条件的研究

利用响应分析法考察了微波处理时间、提取时间和水料比3个因素对微波提取酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取率的影响。研究发现,谷胱甘肽的最佳提取条件为：微波处理20．96s、提取时间为13．25min,加水量与干细胞的比为22．20mL／g,谷胱甘肽的提取率为13．06mg／g,比单因素试验最高的提取率高8．3％,且与预期值相符。     

黑曲霉与酿酒酵母原生质体的形成和再生的研究

对黑曲霉与酿酒酵母原生质体的形成和再生条件进行了研究，得出黑曲霉原生质体形成和再生的较优条件为：混合酶浓度０．８％，酶解时间２小时，酶解温度３４％。酿酒酵母原生质体形成和再生的较优条件为：蜗牛酶浓度２％，酶解时间９０分钟，酶解温度３０℃。     

面包酵母生物合成ATP的影响因素及机理初探

在对面包酵母生物合成ATP的影响因素研究的基础上，初步探讨了生物合成ATP的反应机理。研究结果表明：在反应体系中直接添加终体积分数为0．5％的甲苯，可显著提高面包酵母细胞膜通透性。Mg^2＋对ATP的合成影响很大，当Mg计浓度为40mmol／L时，ATP合成量达到最大值，为9．02mmol／L。在面包酵母生物合成ATP的过程中，当葡萄糖磷酸化和腺苷磷酸化反应竞争时，葡萄糖磷酸化快于腺苷磷酸化，在体系中其它需能反应结束后ATP才开始大量积累。在面包酵母经糖酵解途径生物合成ATP的前期，NAD的再生主要通过形成甘油和乙醇来实现，而在生物合成ATP的中期和快速合成期，NAD的再生主要是通过形成乙醇来实现。     

酒精酵母Saccharomyces cerevisiae 4-S的高密度培养及其酒精发酵性能

实验比较了分批培养、分批补料及连续流加培养对酒精酵母细胞生长的影响。结果显示,分批补料流加或连续流加(流加速率0.133 g.L-1.m-1)有利于酒精酵母菌Saccharomyces cerevisiae4-S的快速生长和得到较高的细胞浓度,分批补料流加或连续流加培养44 h,发酵液中酒精酵母细胞浓度分     

酿酒酵母胞内代谢关键酶对乙醇的耐受性

分别添加2％、4％、6％、8％乙醇的酵母细胞糖酵解途径和三羧酸循环中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、异柠檬酸裂解酶活力等关键代谢节点处的酶活力,以期考查关键酶对酒精的耐受性.实验结果表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对酒精的耐受能力较强,添加8％乙醇时的酶活力较无乙醇时提高23....     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

酿酒酵母胞内代谢关键酶对乙醇的耐受性

分别添加2%、4%、6%、8%乙醇的酵母细胞糖酵解途径和三羧酸循环中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、异柠檬酸裂解酶活力等关键代谢节点处的酶活力,以期考查关键酶对酒精的耐受性。实验结果表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对酒精的耐受能力较强,添加8%乙醇时的酶活力较无乙醇时提高23.65%;丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶和乙醇脱氢酶表现出对酒精的耐受力较差,丙酮酸激酶和乙醇脱氢酶在添加2%乙醇时的酶活力较无乙醇时分别降低77.7%和62.72%,异柠檬酸脱氢酶在添加8%乙醇时的酶活力仅为0.003U;苹果酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶表现出对酒精良好的耐受性,在添加8%乙醇时的酶活力较无乙醇时分别提高256.25%和276.16%。     

响应面法优化酿酒酵母高产谷胱甘肽的发酵条件

利用响应面法对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YZM14高产谷胱甘肽(GSH)的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计法筛选出葡萄糖质量分数、酵母膏质量分数和初始pH对GSH产量的影响最为显著。在此基础上通过最陡爬坡试验逼近最大响应值区域,并采用Box-Behnken试验设计和响应面分析确定了最优的高产谷胱甘肽发酵条件:葡萄糖质量分数为2.54%,酵母膏质量分数为1.03%,(NH4)2SO4质量分数为0.5%,MgSO4.7H2O质量分数为0.1%,KH2PO4质量分数为0.1%,初始pH为5.88,装液量为50mL于250mL三角瓶,发酵温度为28℃,发酵时间36h。在此条件下,GSH产量为125.42mg/L,比无机发酵培养基提高了75.37%。     

高产S-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母发酵条件的响应面法优化

利用Design Expert软件,采用Plackett-Burman(PB)设计和响应面法(RSM)对产S-腺苷蛋氨酸(SAM)的酵母菌株的发酵条件进行优化,PB实验设计及分析结果表明,接种量、L-Met质量浓度、发酵时间是影响SAM胞内产量的3个显著因素。在此基础上通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并采用Box-Behnken实验设计及响应面分析确定了发酵产SAM的最佳条件为接种量10%,L-Met质量浓度为4.0g/L,发酵时间56h,发酵温度30℃,pH为6.0,在250mL三角瓶中装液量60mL,种龄24h,摇床转速180r/min。最终优化后的SAM胞内产量达到287.615 7mg/g,比初始产量提高1.38倍。     

br基因的克隆及表达

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)是嗜盐菌细胞膜上唯一的一种光能转换色素蛋白,BR以视黄醛(retinal)作辅基,在光诱导下吸收光子后会产生一系列的光循环中间体,最后又回到原始状态．由于BR这种独特的分子结构和光循环过程,及其作为一种具有光敏特性的蛋白质生物分子,可嗵过生物学技术进行改造,正引起光子学研究及生物学研究领域的高度注意．从Genbank查询br基因的全序列,然后采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,采用DNA star软件辅助设计了上下游引物,以嗜盐菌(Halobactrium Halobium)的基因组DNA为模板克隆获得了完整的细菌视紫红质基因br,并且将经测序鉴定的br基因重组到原核高效表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coli．,将阳性转化子经IPTG诱导表达获得BR与GST(谷胱苷肽转移酶)的融合蛋白后,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western印迹反应,检测表达结果为阳性,且表达蛋白的大小与预想的一致．     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

人源性rhG-CSF单链抗体基因的克隆和表达

从构建的噬菌体表面展示文库中，筛选出全新的人源抗重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）特异单链抗体（ScFv）的噬菌体克隆。ScFv被克隆到pCANTAB 5E载体上，以E. coli TG1为宿主，进行噬菌体表面呈现，以rhG-CSF为靶抗原进行免疫亲和富集筛选，经酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定，得到一株高亲和力克隆。DNA序列分析表明，该ScFv基因全长733 bp，其中重链可变区（VH）为366 bp，轻链可变区（VL）为322 bp。抗rhG-CSF的ScFv在E. coli HB2151中以可溶形式分泌表达，产物主要分布于周质中，占周质总蛋白的质量分数为20%～25%，经免疫印迹试验（Western-blot）分析显示该单链抗体黏均分子量为31 kD。     

福寿螺多功能纤维素酶EGXA在酿酒酵母中的表达

研究在酿酒酵母中表达福寿螺内源性纤维素酶基因egxa cDNA。结果显示：重组酶水解对一硝基酚纤维二糖苷（pNPC）、微晶纤维素（sigmacell）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）以及Oatspelt的木聚糖（xylan from oat spelt，麦木聚糖）等4种底物的活力分别为1．25，84，70和196U／L，并发现了天然信号肽，酵母性因子信号肽（MRl）对重组酶表达的影响。