关键介质组分和培养条件对重组巴斯德毕赤酵母表达内切几丁质酶的影响

目的:考察关键介质组分和培养条件对重组巴斯德毕赤酵母工程菌ZJGSU02表达内切几丁质酶的影响.方法:以内切几丁质酶活力为指标,采用单因素试验对影响其活力的关键因素——甲醇浓度、油酸、Tween-80和PTM1以及培养条件pH、pH体浓度和装液量进行初步优化.结果:关键介质组分甲醇、油酸、Tween-80和PTM1的体积分数分别为0.5%、0.05%、0.4%和0.6%,培养条件pH 6.0、菌体比例3∶1和装液量25 mL/100 mL时,重组菌培养72 h所得内切几丁质酶活力最高,即89.3 U/mL,比未优化条件下酶活力高3.26倍.结论:本研究结果可为通过酶法降解废弃几丁质制备高生理活性的几丁寡糖提供技术支持.     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

新食品原料壳寡糖的酶法生产研究

目的针对高分子原料壳聚糖在食品工业应用中的两大难题——清洁生产与安全食用,研究了内切壳聚糖酶EC.3.2.1.132在新食品原料壳寡糖工业生产中的应用。方法通过广泛筛查,选育产酶活性高、性能稳定、具有单一内切模式的野生菌种。综合应用生物工程技术构建高效表达的基因重组工程菌,经优化发酵条件、建立简易纯化方法,获得了专一性内切壳聚糖酶。采用循环型清洁生产工艺用于新食品原料壳寡糖的工业化生产。结果从产酶量10 U/mL左右的野生型曲霉菌株Jxsd-01获得成熟基因,构建重组毕赤酵母工程菌表达体系,内切壳聚糖酶蛋白产量达到0.95 g/L。采用循环型清洁生产工艺酶法生产的壳寡糖含量高达98%,聚合度n=2~10,原料转化率95%以上,生产过程中无废水、废渣产生。结论内切壳聚糖酶应用于食品工业,实现新食品原料壳寡糖的工业化酶法生产,达到清洁、安全、高效的效果,具有应用推广的价值。     

重组大肠杆菌ZJGSU01高效表达内切几丁质酶的培养条件

目的:研究重组大肠杆菌ZJGSU01高效表达内切几丁质酶的最优化培养条件.方法:以内切几丁质酶活力为指标,对诱导剂的诱导时间、诱导剂的添加量、装液量和接种量进行优化.结果:接种量5%,装液量100mL/500mL,重组菌培养1 h.添加诱导剂IPTG的浓度为1.0mmol/L,有利于内切几丁质酶的表达.结论:通过上述条件的优化,可明显提高内切几丁质酶的表达量.     

内切壳聚糖酶在食品级壳寡糖酶法生产中的应用

研究1株曲霉JXSD-01发酵液中内切壳聚糖酶(eCSN)的纯化与功能,以寻求一种清洁的生产不含单糖的壳寡糖的方法。经分析,不含外切酶活性的eCSN蛋白酶比活力＞50U/mg,分子质量为25kD,酶的最适温度为63℃,最适pH6.5。经N末端测序,内切壳聚糖酶的N端序列为YNLPNNLKQ。eCSN用于天然大分子壳聚糖的生物降解,可获得分子质量在1000～3500D的寡糖聚合物,其中无单糖污染,达到国际食品级壳寡糖质量标准。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

响应面法优化微波辅助果胶酶制备壳寡糖的工艺

为优化壳寡糖制备工艺,提高壳寡糖得率,以壳聚糖为原料,采用微波法辅助果胶酶酶解壳聚糖制备壳寡糖,以还原糖含量作为壳寡糖的产率依据,通过单因素实验和响应面实验确定最佳工艺条件为:果胶酶加酶量2100 U/g,微波功率510 W,pH4.4,反应温度50℃,在此工艺条件下获得的降解产物中还原糖浓度为1.964 mg/mL,与单一果胶酶酶解法(1.747 mg/mL)相比提高了12%,与单一微波法(1.671 mg/mL)相比提高了18%。     

耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因,并异源表达制备重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶（CsnBh46）,通过表征分析获得重组CsnBh46酶学特性。重组CsnBh46全长278个氨基酸,三维结构显示其分为上下两个半球,包含9个α螺旋和2个β折叠。在7 L发酵罐中,重组工程菌bh-5的最高酶活力和总蛋白质质量浓度分别为6 375 U/mL和4.3 g/L。纯化后的重组CsnBh46最适反应pH和温度分别为6.0和60 ℃,金属离子Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对重组CsnBh46具有激活作用。重组CsnBh46最适底物为脱乙酰度95%胶体壳聚糖。重组CsnBh46能够高效水解胶体壳聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖。本研究为CsnBh46产业化应用奠定基础。     

海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50产嗜热性壳聚糖酶CsnSH50的酶学性质表征及其应用

实验室从中国海南滨海虾蟹养殖区泥土样品中筛选到一株高产壳聚糖酶的海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50,优化后该菌株产酶时间仅为12 h,产酶活性可达26.6 U/mL。该研究对其胞外壳聚糖酶进行分离纯化和酶学性质表征并进行壳寡糖制备的小试放大试验,以期进一步明确该菌株在壳寡糖生产上的实际意义。结果表明：壳聚糖酶CsnSH50分子量约为41 ku,纯化后CsnSH50比酶活力为7 462.50 U/mg,最适反应pH值为4.5,温度为75 ℃,在pH值2.5~8.5及温度低于50 ℃条件下稳定性较好。最适条件下,稀释后CsnSH50的最大反应速率Vmax=29.41 U/mL,米氏常数Km=1.71 mg/mL,1 mmol/L的K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+对CsnSH50的酶活力有明显正激活效应,10 mmol/L的Mn2+对其正激活效应可达412%。TLC和ESI-MS结果表明：CsnSH50水解壳聚糖的最终产物主要为壳二糖、三糖、四糖。小试放大试验结果显示：制备5%（m/V）壳寡糖溶液时,壳聚糖溶液的初始pH值3.5,温度75 ℃,水解120 min时壳寡糖产率达到92.1%,产物平均聚合度为10.2。综上,CsnSH50具有酶活性高、热稳定性好、耐酸等特性,同时是一种鲜有报道的嗜热性壳聚糖酶,具有良好的工业应用潜力。     

萎缩芽孢杆菌Rk1壳聚糖酶高效制备及特性表征

壳聚糖酶在壳寡糖酶法制备过程中发挥重要作用,高效制备壳聚糖酶为其产业化应用奠定基础。采用同源克隆获得萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)Rk1壳聚糖酶基因(bacsn46)。将密码子优化和分子伴侣蛋白共表达进行结合,实现萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶(BaCsn46)高效表达。通过表征分析获得重组BaCsn46酶学特性。bacsn46基因全长825个碱基,编码274个氨基酸,其中前32个氨基酸为信号肽序列。在7 L发酵罐条件下,重组菌最高发酵酶活力和总蛋白质量浓度分别达到7 356 U/mL和5.95 g/L。重组BaCsn46最适反应温度和pH分别是60℃和6.0,金属离子Mg²⁺和Mn²⁺对重组BaCsn46具有激活作用,重组BaCsn46最小和最适水解底物分别是壳四糖和95%脱乙酰度胶体壳聚糖。此外重组BaCsn46能够高效水解不同浓度胶体壳聚糖,制备不同聚合度壳寡糖。     

大豆蛋白—壳聚糖共价复合物制备研究

通过干热反应将壳寡糖引入大豆蛋白,形成大豆蛋白―壳寡糖共价复合物,采用响应面方法对大豆蛋白―壳寡糖制备条件进行优化,建立以乳化性及乳化稳定性为响应值回归方程。以乳化性为响应值时,优化结果为:反应时间10.4 h,反应温度41.2℃,壳聚糖添加量25.7%;以乳化稳定性为响应值时,优化结果为:反应时间9.6 h,反应温度38.3℃,壳聚糖添加量26.1%。     

壳聚糖酶的研究进展

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)是一种糖基水解酶,主要来源于细菌和真菌,以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的β-1,4-氨基葡萄糖苷键,生成壳寡糖。由于壳聚糖酶可以用于制备具有独特生物活性的物质——壳寡糖,因而在医药、食品、化妆品等领域有广泛的应用,也引起越来越多的科研人员对该酶的关注。文章总结了壳聚糖酶在生化特性、遗传改良及其应用等方面的最新研究进展。     

重组大肠杆菌合成内切几丁质酶培养条件的优化

目的:探讨重组大肠杆菌合成内切几丁质酶培养条件的优化。方法:首先采用部分因素试验设计研究发酵培养基中各组分对产内切几丁质酶比活力的影响,找出主要影响因素,然后采用Box-Behnken设计确定各主要影响因素质量浓度的最佳值。结果:影响重组大肠杆菌合成内切几丁质酶的主要因素为葡萄糖,Na_2HPO_4·12H_2O和KH_2PO_4。最优化的发酵培养基组成(g/L):蛋白胨14,葡萄糖8.8,Na_2HPO_4·12H_2O 16.8,NH_4Cl 1,MgSO_4·7H_2O 0.14,酵母粉6,KH_2PO_4 2。在优化发酵培养基中重组大肠杆菌产酶量是未优化发酵培养基的1.67倍。结论:本研究结果为内切几丁质酶产业化生产提供了良好基础。     

抗真菌内切几丁质酶酶学性质及制备低聚壳寡糖功能分析

为开发几丁质及壳聚糖生物转化活性寡聚糖并实现几丁质酶在食品防腐及生防方面的应用,从金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)XZ-Sa62中分离纯化几丁质酶(ChiA-Sa62),并研究其生物转化及抗菌功能。本实验采用Q-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100层析和反相高效液相色谱纯化ChiA-Sa62,经纯化后ChiA-Sa62纯化倍数为41.3倍,比活力为1 119.8 U/mg。并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测得ChiA-Sa62是分子质量为62.55 kDa的单亚基蛋白。ChiA-Sa62在50℃和pH 5.0的条件下,活性最高,并在60℃以下及pH 3.0～9.0范围内有良好稳定性。金属盐离子Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺和Co²⁺可激活酶活性。ChiA-Sa62对几丁质及脱乙酰度75%的壳聚糖具有专一内切水解活性,薄层色谱显示,水解产物分别为2～5个N-乙酰氨基葡萄糖单位的几丁寡糖和2～4个D...     

酶膜耦合法制备高聚合度壳寡糖

为了制备高聚合度壳聚糖,本研究通过对比分批酶解法和酶膜耦合法制备所得壳寡糖产物的聚合度差异,探索了利用酶膜耦合技术高效富集制备高聚合度壳寡糖的可行性。研究结果表明,酶膜耦合方法所得壳寡糖产物中DP 4~8壳寡糖的总收率高达78.1%,DP 4~8壳寡糖所占比例分别为16.5%、35.8%、18.9%、7.81%和5.12%。同时,以卷式膜系统代替板式膜系统,通过错流过滤的方式,可以有效降低实验过程中的不可逆膜污染(R_if=1.56×10⁶ m^-1),提高了料液底物浓度(30 g/L)。综上所述,本研究建立了一种基于酶膜耦合技术的高聚合度壳寡糖连续制备工艺,为高聚合度壳寡糖的应用和功能研究提供了基础。     

超声波辅助酶法制备壳寡糖及抗氧化活性研究

壳寡糖是壳聚糖降解后的产物,其与壳聚糖相比分子量更小,水溶性更好,生物利用度更高的特点。本实验拟采用超声波辅助果胶酶处理壳聚糖制备壳寡糖,通过正交试验优化制备工艺。结果表明,最佳工艺条件为:酶浓度1600 U/g,酶解温度50℃,反应时间60 min,超声波功率120 W。在该条件下获得的降解产物中还原糖浓度为1.96 mg/mL,制备效果优于超声波和酶解分别降解的方法。对此法制备的壳寡糖的体外抗氧化活性进行研究,结果表明对DPPH自由基和羟自由基均有较强的清除能力。     

强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1?000～5?000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。     

产壳聚糖酶菌株的筛选及壳寡糖性质的研究

采用透明圈法筛选，从天然土样中获得产壳聚糖酶的野生菌株6株。将其中一株高产壳聚糖酶的微生物菌株命名为BK2。用发酵酶液降解壳聚糖，制备壳寡糖。壳寡糖的抑茵性和溶解性，研究结果表明，壳寡糖对一些常见细菌、霉菌、酵母菌等微生物的生长均有不同程度的抑制作用，它在微酸性的条件下，溶解性及抑菌性较好。     

高浓度壳聚糖溶液酶解条件优化

在研究了壳聚糖酶的温度和pH稳定性的基础上,通过在溶解过程中加酶对高浓度壳聚糖溶液酶解条件进行优化,考查了加酶时间及加酶量对8%壳聚糖溶液酶解效率和酶解液粘度的影响,并对优化前后目标溶液中几种壳寡糖的含量进行分析。结果表明:壳聚糖酶在45~55℃及pH4.5~5.5范围内保持稳定;对8%壳聚糖溶液体系,在滴加盐酸浓度达到0.17 mol/L时,加入2 U/g壳聚糖的酶液,当盐酸浓度达到0.48 mol/L时再补加3 U/g壳聚糖的酶液,这种方案可以有效降低体系粘度并保持酶活力;薄层色谱和高效液相色谱分析结果表明,通过以上方式的优化,聚合度2~6的壳寡糖总含量及壳五糖和壳六糖的含量均显著增加(p<0.05),分别达到42.7、5.5和3.9 mg/mL,大大提高了生产效率和降低浓缩成本。     

壳聚糖酶法降解工艺优化及其产物的抗氧化活性

在单因素试验的基础上,运用响应面分析法优化壳聚糖酶法催化成壳寡糖的条件及其酶解产物DPPH自由基清除活性。根据单因素试验结果固定壳聚糖底物质量浓度为2 g/100 m L,选取不同酶底比、酶解时间、壳聚糖溶液p H值和酶解温度作自变量,以酶解产物清除DPPH自由基能力为响应值,应用Box-Behnken中心组合法进行四因素三水平试验设计。研究结果表明,4个因素对酶解产物DPPH自由基清除能力的影响为:壳聚糖溶液p H值﹥酶解反应温度﹥酶底比﹥酶解反应时间。通过二次回归模型响应面分析酶解产物DPPH自由基清除活性最佳优化条件为酶解反应时间64 min,E/S 36%,壳聚糖溶液p H 4.6,反应温度54℃。壳聚糖酶解产物实际DPPH自由基清除能力达92.60%,与模型理论值92.36%相比,误差为0.26%。由响应面法优化得到的壳聚糖酶解产物具有较好的DPPH自由基清除能力,值得进一步研究与应用。