ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中的克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒(载体)pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶(EC 4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

CYS3基因的敲除及其对Saccharomyces cerevisiae3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3敲除对S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响。将编码胱硫醚-γ-裂解酶的CYS3基因和抗性标记基因Zeocin克隆,构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin,醋酸锂法将其转化导入S. cerevisiae S288C表达,构建CYS3基因敲除的工程菌。结果表明：摇瓶发酵120 h时,工程菌S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分别为0.60 g/L和0.94 g/L,S. cerevisiae C3较野生型S288C的3-甲硫基丙醇生成量降低36.2%。说明CYS3基因敲除对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇有较大影响,并呈现负调节作用。     

发酵液中3-甲硫基丙醇及其衍生香料的HPLC同步检测方法的研究

建立了3-甲硫基丙醇及其衍生香料、底物氨基酸的HPLC同步检测方法,为3-甲硫基丙醇及其衍生香料的微生物筛选、转化制备提供基础。优化出的HPLC同步检测条件为：色谱柱SunFireTMC18、光电二极管阵列检测器、不同配比的水/乙腈梯度洗脱、流速1mL/min;柱温30℃;检测波长210nm,在此条件下,3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙酸甲酯、L-蛋氨酸有较好的分离峰,重复性RSD分别为3.7%、1.8%、3.9%和3.9%,3-甲硫基丙醇的回收率在94.3%～101.4%,L-蛋氨酸的回收率在102.2%～105.5%。该方法稳定性好,准确度较高,适合用于快速检测发酵液中3-甲硫基丙醇及其衍生香料和底物。     

发酵液中3-甲硫基丙醇及其衍生香料的HPLC同步检测方法的研究

建立了3-甲硫基丙醇及其衍生香料、底物氨基酸的HPLC同步检测方法,为3-甲硫基丙醇及其衍生香料的微生物筛选、转化制备提供基础。优化出的HPLC同步检测条件为:色谱柱SunFireTMC18、光电二极管阵列检测器、不同配比的水/乙腈梯度洗脱、流速1mL/min;柱温30℃;检测波长210nm,在此条件下,3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙酸甲酯、L-蛋氨酸有较好的分离峰,重复性RSD分别为3.7%、1.8%、3.9%和3.9%,3-甲硫基丙醇的回收率在94.3%～101.4%,L-蛋氨酸的回收率在102.2%～105.5%。该方法稳定性好,准确度较高,适合用于快速检测发酵液中3-甲硫基丙醇及其衍生香料和底物。