离子强度对于牛精蛋白在大肠杆菌中的表达的影响

通过基因合成将大肠杆菌偏好的精氨酸密码子CGT取代野生型牛精蛋白基因中的稀有精氨酸密码子AGA和AGG，得到密码子优化的牛精蛋白基因，并将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，可得到一33kD融合蛋白表达带，首次成功地将牛精蛋白在大肠杆菌中进行了表达，但其表达量很低，约为总菌体蛋白的13％。增加表遂菌株培养液的离子强度，可将蛋白表达含量提高到28％，且蛋白表达量与离子强度呈正相关。纯化后的牛精蛋白可在体外条件下与DNA发生结合。     

龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用PCR扩增方法得到真核红藻－龙须菜藻红蛋白亚基基因序列,与其它6种已知红藻相应序列比较,显示了很高的保守性。在7株藻中β亚基比α亚基保守,α亚基倾向于小区域保守,而β亚基倾向于大片段的保守。该蛋白必需氨基酸的含量较高。藻红蛋白亚基基因在大肠杆菌中达到较高的表达量,诱导4小时,特异表达产物占菌体可溶性蛋白的44％,表达产物呈溶解状态,而两亚基可能是分别翻译的。     

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG－1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性,使用PCR的方法扩增人HRG－1基因ORF的编码序列,构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定,实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG－1原核表达蛋白,且人HRG－1原核表达蛋白具有真核表达蛋白一致的生物学活性。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。     

一种蛋白质纯化流程用于提纯大肠杆菌表达的蛋白片段

用一种新的蛋白质纯化流程提纯由大肠杆菌表达的夏氏疟原虫AMA1片段。大肠杆菌表达的片段首先用镍柱提纯，提纯后的蛋白用DTT还原，对盐酸胍透析，再对空气氧化。用RP－HPLC对片段二次提纯，通过冻干转换缓冲液。SDS－PAGE、RP－HPLC和质谱分析都显示，经这种纯化流程提纯的蛋白有很高的纯度，且二硫键已完全正确形成。提示这一蛋白质纯化流程可用于由大肠杆菌表达的低分子量寡二硫键的蛋白。     

抗夏菌蛋白Rs—AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响，利用PCR重叠延伸法，对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变，构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA)，第5号氨基酸G1n相差一个碱基(CAG→CAA)，第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物，将切除信号肤的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b( )分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后，二者均得到了表达。软件分析显示，突变前pETAFPm表达产物占全菌蛋白的3％，突变后pETAFPo的表达产物占全菌蛋白含量的8％；表达蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经超声波破碎后，蛋白质复性，抑菌结果表明，pETAFPm。表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效地提高表达量。     

在大肠杆菌中表达蜘蛛拖丝融合蛋白

蜘蛛丝凭借其优良的理化性质倍受人们青睐,但是蜘蛛本身难以高密度养殖给应用造成巨大的障碍。由此利用基因工程的手段来开发利用蜘蛛拖丝蛋白目前成为各国研究的热点。以往的研究表明,不同的编码蛛丝蛋白的cDNA片段在表达中的稳定性各不相同。在应用中存在适宜片段的筛选问题。本文从该角度出发,首次建立了Araneus diadematu克隆的拖丝蛋白基因ADF3与GSF融合产物的稳定原核表达系统。为今后进一步开发利用蜘蛛拖丝蛋白的研究奠定了基础。     

靛蓝色素酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

将来源于Ralstonia eutropha磁中的靛蓝色素酶基因IDG与从棉花基因组DNA中克隆到的棉纤维特异启动子PTL12相连构建了真核表达载体。该表达载体中包含靛蓝色素酶基因的原核启动子，它能在大肠杆菌中启动靛蓝色素酶基因的表达。     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。     

人重组血管生成素在大肠杆菌的表达与鉴定

利用ＰＣＲ技术从人肝细胞文库中扩增出血管生成素的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，在大肠杆菌成功地表达出人重组的Ａｎｓ融合蛋白和Ａｎｇ非融合蛋白，表达量占体蛋白的２５％，有明显的促进新生血管生成作用和ＲＮＡ酶及Ｌ９２９细胞粘附活性。     

玻璃载银抗菌材料的Ag+溶出性质及与大肠杆菌作用机理

研究了玻璃载银抗菌材料的Ag~+溶出性质及其与大肠杆菌作用的过程、效果和抗菌原理。通过X射线衍射仪(XRD)测试发现材料为非晶态物质,激光粒度仪分析表明材料平均粒度D_(50)在10μm以下,且粒度分布范围较宽。最小抑菌浓度方法(MIC)测试表明样品的最小抑菌浓度值为0.2mg/mL,抑菌效果显著;并发现样品粒度分布在20μm以下时对抑菌性能影响不大。采用原子吸收法分析了样品的Ag~+溶出量,发现样品Ag~+溶出量随时间延长而增加,粉体粒度越小Ag~+越容易溶出。与大肠杆菌悬液混合后混合液中Ag~+浓度明显低于纯样品,可能是被细菌吸附所致。对玻璃载银抗菌材料和大肠杆菌作用混合体进行定型、负染,并用透射电镜(TEM)观测其切片前后的形貌,结果发现玻璃载银抗菌材料处理后的大肠杆菌有菌细胞溃烂融溶、菌体断裂现象;而切片样品发现了菌内空泡变性。分析认为玻璃载银抗菌材料中Ag~+溶出,进入菌体内部,攻击细胞核质,使细菌细胞破溃死亡。     

新型高抗草甘膦N-乙酰转移酶基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

利用草甘膦极端污染土壤总DNA,构建了元基因组文库,筛选到一个高抗草甘膦的N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase,GAT)基因,并利用原核表达系统对该基因进行了功能鉴定,发现其在大肠杆菌BL21中能耐受高达300 mM的草甘膦.研究结果为进行N-乙酰化途径高抗草甘膦机理研究和新型高抗草甘膦转基因作物的开发提供了理论基础.     

长程表面等离子体共振技术在检测大肠杆菌浓度中的应用研究

建立了一种基于长程表面等离子体共振技术检测大肠杆菌浓度的方法及系统。基于此,制备了能够产生长程表面等离子体共振效应的双层膜传感芯片,并在实验上将长程表面等离子体共振(LSPR)和传统表面等离子体共振(CSPR)两种生物传感器的性能进行了对比。结果表明LSPR生物传感器共振曲线的平均半高宽比CSPR传感器共振曲线的平均半高宽窄1.79倍,且其灵敏度是CSPR的2倍。由此,证实了基于LSPR的生物传感器对大肠杆菌浓度的改变更加敏感。此外,该方法分辨率高,试剂用量少,有效克服分界面所带来的影响,并能够对大肠杆菌进行实时检测。     

Modelling and characterisation of surface plasmon based sensors for the detection of E. coli

The finite element method based on the full-vectorial H-field formulation incorporating the perturbation techniques has been employed to calculate the complex propagation characteristics, the formation of the coupled supermodes, and power fraction in the different regions, modal loss, differential loss and coupling length. The influence of the outer medium refractive index on the inner and outer surface plasmon modes (SPR) is investigated to achieve the best coupling and sensitivity. Finally the SRP fibre optic sensor design is numerically optimised for the maximum field penetration in the outer medium