提高α-葡萄糖苷酶抑制率的乳酸菌胞外多糖分阶段控温发酵工艺优化

该文在考察不同温度对人源乳酸菌菌体生长、胞外多糖浓度及α-葡萄糖苷酶抑制率影响的基础上,采取分阶段控制温度策略对α-葡萄糖苷酶抑制活性进行优化。结果表明,当第一阶段温度37℃,变温时间50 h,第二阶段温度40℃发酵66 h时α-葡萄糖苷酶抑制率为58.21%。     

透明质酸分批发酵过程中温度的间歇控制

用兽疫链球菌进行摇瓶发酵,研究了30℃～40℃范围内不同温度对透明质酸(HA)分批发酵的影响,结果表明,34℃时菌体量最大,最大细胞干重为13.1g/L,38℃时HA的产量最高,其产量为82mg/100mL.在此基础上提出了分阶段间歇温度控制策略,通过L9(34)正交试验确定出最优的发酵条件为0～12h控制发酵温度为34℃,到12h时,改变发酵温度为40℃,14h时再改至34℃,这样每隔2h交替改变HA的发酵温度,直到发酵结束.在此间歇变温条件下发酵与恒温发酵相比HA产量提高了38.20%.     

特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化

应用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)表达系统实现特异腐质霉(Humicola insolens,H.insolens)来源角质酶的重组表达。对重组角质酶进行酶学性质研究,发现其最适pH为8.5、最适温度为80℃,并有良好的pH稳定性和温度稳定性。经3L发酵罐中扩大培养并进行发酵条件优化,其最佳发酵条件:发酵前期控制菌体生长pH 7.0、温度37℃,培养时间12~14h;菌体浓度OD600达到50时进入诱导期,调节温度降至30℃,恒速流加0.2g/(L·h)的乳糖溶液进行诱导,总发酵周期为36h,最高酶活2 233U/mL,是摇瓶水平酶活的13倍。     

Pseudomonas sp.TUC13变温发酵生产几丁质酶的研究

考察不同温度（25℃-41℃）对菌株Pseudomonas sp．TUC13菌体生长和产几丁质酶的影响,在此基础上,提出TUC13发酵生产几丁质酶的变温控制策略,并采用正交试验设计法对变温发酵的主要工艺参数进行优选、经对试验结果的统计分析,TUC13变温发酵产几丁质酶的最佳温度控制方案为：发酵初期温度控制在37℃条件下培养,55h后改为30℃继续培养至发酵结束。采用优化后的变温培养工艺,发酵液几丁质酶酶活性达到1737．1U／mL,较采用恒一温度（29℃）发酵几丁质酶酶活峰值提高16．6％。     

两阶段转速调控对纳豆芽胞杆菌合成维生素K2的影响

为进一步提高纳豆芽胞杆菌合成维生素K₂的能力,根据前期不同转速对维生素K₂产量影响的结果,在250 mL摇瓶中考察转速0（产量最大）和200 r/min（产量其次）对菌体生长和产物生成的影响。通过分析不同条件下发酵进程曲线与发酵动力学参数,并对不同时间点的发酵液进行稀释涂布和扫描电镜观察菌体形态变化,提出两阶段转速调控策略,并对影响此调控策略的条件（温度、转速、pH和时间）进行正交优化。0 r/min、108 h产量最高,发酵后期菌体形态多为褶皱,200 r/min菌体数量高于0 r/min,菌体在发酵后期破碎较多,少数表面平整;优化后在40 ℃、pH 6.5、0~36 h控制转速220 r/min,36~132 h转速为0 r/min,维生素K₂的产量为（35.60±0.13） mg/L,比优化前（0、200 r/min）分别提高了1.67倍和9.674倍。分阶段调控转速可以有效提高纳豆芽胞杆菌合成维生素K2的能力,对维生素K₂的大规模生产具有重要的指导意义和参考价值。     

两阶段温度控制策略以及助剂促进淀粉分支酶的胞外表达

为了促进重组淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)中的胞外表达,对重组淀粉分支酶在摇瓶水平上进行了发酵优化。首先,以胞外酶活力为指标,先后考察了初始培养基、p H、培养温度和培养时间4种因素对胞外表达的影响;然后,通过两阶段温度策略和助剂的添加进一步提高胞外表达水平。结果表明,当发酵培养基为TB、p H为7.5时,25℃培养24 h后胞外酶活力达到19.9 U/m L;同时,菌体生长最适温度和酶分泌的最适温度是不一致的,通过两阶段温度控制策略(即0~12 h控制温度30℃,12 h后温度调至25℃),胞外酶活力与单一温度条件下的最高水平(25℃)相比提高了1.4倍,达到了47.1 U/m L;在此基础上,进一步添加0.05%的吐温-80,将胞外酶活进一步提高40%,达到65.8 U/m L。     

温度对异亮氨酸发酵的影响

研究温度控制对大肠杆菌TRFCL-异亮氨酸补料分批发酵过程中生物量、异亮氨酸产量、比生长速率、质粒稳定性及副产物乙酸的影响.结果:以34C～36C分段控温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-异亮氨酸产量提高了10.9％;应用以上措施,乙酸含量得到有效减少,使菌体生物量、质粒稳定性及L-异亮氨酸产量得到有效提高,达到了高密度发酵培养的目的.     

枯草芽孢杆菌发酵生产利巴韦林的变温控制策略研究

以枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)TM903为供试菌株,考察了不同的培养温度(34～40℃)对利巴韦林摇瓶发酵的影响。结果发现,38℃条件下菌体生长最好,利巴韦林产量最高,可达4.12g/L。基于上述结果,研究了3种变温控制模式条件下利巴韦林摇瓶发酵过程。得出如下结论:0～24 h发酵温度为38℃,24 h后每6 h提高2℃,并采用这种温度控制方式进行5L自控发酵罐试验,60h后可积累利巴韦林5.86 g/L,比同类研究的产量(4.69 g/L)提高了24.95%。     

韦伯灵芝漆酶生产中试研究

以韦伯灵芝(Ganoderma weberianum)TZC-1为生产菌株,在前期优化的摇瓶培养条件和5 L发酵罐小试生产工艺条件的基础上,对该菌株在50 L发酵罐进行中试放大,确定韦伯灵芝漆酶在50 L发酵罐的中试发酵工艺参数。结果表明:以3 d种龄种子按8%的接种量转接至发酵罐进行中试发酵,发酵温度28℃,装液量30L,采用分阶段控制p H和溶解氧浓度(DO)的策略,发酵初期(0~48 h)p H控制在6.0,48 h后p H控制在4.5~5.0范围内;0~36 h内控制搅拌转速100 r/min,通气量10 L/min;36~72 h内控制搅拌转速150 r/min,通气量15 L/min;72~96 h内控制搅拌转速200 r/min,通气量20 L/min;96 h至发酵结束搅拌转速250 r/min,通气量15L/min。发酵前72 h DO保持在15%~30%有利于菌丝生长,72 h后DO保持在10~15%有利于漆酶的积累。发酵144 h选择放罐,可获得18.8 L发酵原液,其漆酶活力可达27 667.7 U/L,是摇瓶发酵水平的2.5倍。     

分阶段控制温度提高胞外多糖产量

利用冬虫夏草头孢菌发酵生产胞外多糖,研究不同温度下对菌体生长和胞外多糖产量的影响。结果表明:26℃是菌体生长的最适温度,28℃是产物积累的最适温度。在此基础上,提出分阶段控制温度工艺。通过响应面法分析,得到优化方案为第一阶段温度26℃,变温时间17 h,第二阶段温度28.5℃,胞外多糖产量10.92 g/L,比28℃恒温培养提高了25.5%。     

气升式反应器中高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程的动态温度控制研究

在利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸(Arachidonic Acid,ARA)过程中,考察了不同规模和培养环境下,单一以及动态温度控制对菌体生长和ARA合成的影响。结果表明:相对于机械搅拌罐,利用气升式反应器发酵生产ARA具有明显优势。同时,较高温度(25℃)有利于高山被孢霉菌体生长,而较低温度(16℃)有利于ARA合成。在此基础上进行动态控温发酵,即起始发酵温度25℃,72h后以每12h下降1.5℃至16℃,然后保持16℃至发酵结束。采用此控制策略,ARA产量达到4.7g/L,与单一温度(25℃)控制相比提高了38.2%。      

阶段控温提高透明质酸酶在毕赤酵母中的表达

透明质酸酶(Hyalurondiase,HAase)是一种具有医药作用的水解酶,为了提高HAase在重组毕赤酵母中的分泌表达量,对重组毕赤酵母诱导阶段的温度进行了优化。研究发现,降低诱导温度可以提高HAase的产量,其中两阶段控制温度诱导策略效果最为显著。诱导阶段0~60 h温度控制在25℃,60~96 h温度控制在22℃,HAase酶活最高为1.18×106U/m L,是诱导温度为30℃时(4.53×105 U/m L)的2.6倍。此外,采用两阶段控制温度诱导策略有利于细胞活性的提高和AOX1启动子的表达。两阶段控制温度诱导策略还可以应用到其他酵母表型中,为毕赤酵母高效表达外源蛋白质提供一种新思路。     

高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA

为了提高酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)的表达量和酶活,使之更高效地催化合成左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA),在摇瓶优化的基础上,研究了溶氧控制策略、补料策略、诱导温度和诱导策略对菌体生长、TPL酶活和L-DOPA产量的影响。结果表明,在5 L发酵罐中25℃诱导条件下,采用DOstat补料策略控制罐内溶氧的体积分数为20%,菌体浓度、TPL酶活和催化合成L-DOPA产量较分批培养分别提高了17. 9%、57. 7%和27. 8%。诱导后控制溶氧体积分数在40%相比于20%更利于TPL的表达,酶活相比于20%的DO的提高了33. 8%。通过优化起始诱导时间,在菌体生长的对数前期(OD_(600)=7)诱导,细胞浓度提高到51. 2 g/L,酶活提高到2. 43 U/mL,L-DOPA产量为56. 58 g/L,较分批培养分别提高了64. 1%、170%和209. 2%。初步实现了重组大肠杆菌高密度培养生产TPL,为L-DOPA产业化研究奠定了基础。     

温度诱导对鼠李糖乳杆菌cspc mRNA基因表达和生长速率的影响

通过在发酵过程中对鼠李糖乳杆菌(LGG)进行温度诱导处理,考察其冷休克蛋白C(cold shock proteins C,cspc) mRNA基因的表达和菌体生长速率的变化。在不同温度、不同时间条件下进行诱导,检测cspc mRNA基因的表达量;在发酵培养的第4、8 h温度诱导菌体,检测其生长速率,并且考察其诱导后菌体的冻干存活率。结果表明:高于37℃温度诱导可使cspc mRNA基因的表达量明显降低,且经43℃、30 min诱导后cspc mRNA基因的表达量最低,并且在生长过程中进行43℃、30 min诱导后菌体的生长速率明显提高且菌体的冻干存活率未降低。综上,高于37℃温度诱导可降低LGG的cspc mRNA基因表达量并提高生长速率。     

分阶段温度控制策略提高重组葡萄酒酵母合成β-胡萝卜素的研究

利用农副产品为发酵底物,生产高附加值的牛物产品具有良好的应用前景。本研究以模拟葡萄汁为培养基,在7L发酵罐水平L研究了不同发酵温度（25℃、27℃、30℃、33℃）重组葡萄酒酵母T73-63生长和合成外源B．胡萝b素的情况。结果发现,重组葡萄酒酵母最适牛长温度与β-胡萝b素最适合成温度是不一致的：较高的发酵温度（30℃）有利于细胞的生长,能够获得较高的牛物量;但较低的温度（25qc）却能够获得较高的比产物合成速率。根据细胞生长和产物合成动力学曲线,提出了两阶段温度控制策略：发酵前20h温度控制为30℃,20h后降低至25℃至发酵结束;在此调控策略下,最高β-胡萝b素产量和β-胡萝b素合成速率分别达到56．42mg／L和1．28rag／（L．h）,与单一温度发酵模式的最高水平（30℃）相比分别提高了25．7％和14．3％。     

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。     

黑曲霉产胺氧化酶培养及诱导条件的优化

黑曲霉可经诱导产生胺氧化酶,该酶具有催化生物胺氧化脱氨生成相应醛、氨气和过氧化氢的特性。黑曲霉胺氧化酶产生分菌体生长和诱导产酶两个阶段。通过单因素试验优化得出黑曲霉产胺氧化酶的菌体生长最佳培养条件：氮源为NaNO3,碳源为麦芽糖,接种量1%,培养时间24 h;诱导产酶的最佳培养条件：诱导氮源为质量浓度60 g/L的正己胺,诱导碳源为葡萄糖,培养时间36 h,培养温度30 ℃,摇床转速160 r/min,初始pH 7.0,胺氧化酶酶活力从诱导前的1 006.5 U/g提升至1 422.4U/g,提高幅度为41.3%。     

拟干酪乳杆菌发酵生产L-乳酸过程中在线生理参数CER和RQ用于指导发酵过程优化

生理参数二氧化碳释放速率（CER）和呼吸商（RQ）对于深入理解生物过程的变化具有非常重要的意义。本研究以拟干酪乳杆菌发酵生产L-乳酸过程为研究对象,解析了发酵过程中CER和RQ变化与细胞生长和代谢之间关系,结果表明,CER与细胞生长速率密切相关,能够有效表征菌体的生长状态,而RQ值能很好地反映过程中代谢途径的变化。将CER和RQ作为在线指导参数,通过分阶段氮源添加策略,使得L-乳酸产率和转化率较原始发酵工艺分别提高了5.9%和3.0%,而且副产物乙酸和乙偶姻的浓度分别下降了31.3%和24.7%。因此,通过生理参数CER和RQ的变化对发酵过程进行优化,能够有效地提高L-乳酸的发酵产量和质量。      

不同温度对β-葡聚糖酶分批发酵动力学的影响

在5 L发酵罐中研究不同温度对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-15菌体生长、底物消耗和产酶量的影响。分批发酵的工艺条件为:搅拌转速400 r/min、通气量1.0 L/(L·min)、p H 7.0、接种量5%、装液系数0.6、发酵温度35~37℃。结果表明:温度升高会导致反应速率加大、生长代谢加快、生产期提前、酶失活速率加快、发酵周期缩短、最终产酶量减少。实验建立了B.subtilis ZJF-15分批发酵的菌体生长、底物消耗和β-葡聚糖酶产酶的动力学方程。     

两阶段pH和搅拌控制策略提高哈茨木霉产β-1，3-葡聚糖内切酶

为提高哈茨木霉(Trichoderma harzianum GIM 3.442)发酵生产β-1,3-葡聚糖内切酶的酶活E_(endo)及其内切酶酶活在总酶活中所占的比例E_(endo)/E_(total),在7 L发酵罐水平考察了不同p H和搅拌转速对菌体和产酶的影响。结果表明,单一p H或搅拌转速的优化不能使菌体生长和产物合成同时达到最优效果。通过分析不同p H和转速下发酵曲线和动力学参数,提出了两阶段p H和搅拌转速控制策略:在发酵前期(0~24 h)控制p H 7.0,搅拌转速100 r/min,发酵后期(24~168 h)控制p H 5.0,搅拌转速200 r/min。β-1,3-葡聚糖内切酶(E_(endo))、酶合成生产强度(Q_(E,endo))和E_(endo)/E_(total)分别达到了407.8 U/m L、3.09 U/(m L·h)和0.71,比优化前分别提高了320.0%、398.4%和65.1%。