巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。      

巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究

经过近二十年的不断发展,巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源基因的表达,并且获得巨大的成功。与其他表达系统相比而言,巴斯德毕赤酵母表达系统对营养物质要求低、基因组结构简单、可进行高密度发酵,这些优点在很大程度上促进外源基因的表达。但是,巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中也存在许多问题,例如只能以甲醇作为唯一碳源、产热量高等,这些因素在一定程度上限制该表达系统的进一步应用。我们对巴斯德毕赤酵母表达系统进行系统的研究与分析,以期为提高外源基因在其中的表达量提供一定的借鉴。     

毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。     

高效液相色谱法测定废毕赤酵母中氨基酸成分

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统，目前已有几百种蛋白在该系统中得到了表达。随着部分蛋白逐渐被应用到工业生产中，其生产中产生的废毕赤酵母的处理将越来越受到人们的重视。本文对实验研究产生的废毕赤酵母中的氨基酸成分进行了分析，为废毕赤酵母的综合处理提供了一条重要思路。     

巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响

目的构建蛋白酶缺失菌株,提高外源蛋白质表达的分泌率与产量。方法构建质粒pRS306/PEP4 L&R,利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因。比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异。结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9．5%。结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展

毕赤酵母是近年来应用广泛、极受青睐的一种外源蛋白表达系统。除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外,研究不同发酵控制条件下,细胞的生理和代谢状态变化,为毕赤酵母细胞提供最优的生长和环境条件并综合考虑发酵成本是成功实现外源蛋白规模化、商业化生产的保障。本文从培养基组分、外界环境条件、细胞比生长速率、生长期甘油流加策略和诱导期甲醇流加策略等方面阐述了发酵过程对外源蛋白表达的影响,并进一步从细胞生理和代谢层面深入讨论了不同发酵过程控制条件的影响机制。      

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究

以壳聚糖为载体,戊二醛作为交联剂,采用载体交联法制备固定化木瓜蛋白酶,并研究了固定化木瓜蛋白酶的最佳固定化条件。结果表明:木瓜蛋白酶的最佳固定化条件为给酶量为40～50mg/g,于pH7.5,25～30℃下,0.4%～0.5%的戊二醛溶液交联12h,所得的固定化木瓜蛋白酶的活力回收率平均达61.6%。     

酱油对酪氨酸酶抑制作用的研究

酪氨酸酶是合成黑色素过程的关键酶,通过测定酱油对酪氨酸酶活性的影响来确定其对酪氨酸酶的抑制作用及抑制机理。结果表明:酱油对酪氨酸酶具有较强的抑制作用,酶抑制率达到50%时(IC50)酱油固形物含量浓度为19.8g/L。酱油对酪氨酸酶的抑制作用动力学行为表现为可逆混合性抑制类型。     

基于电子鼻和乙醇传感器判别草莓新鲜度的研究

以红颜草莓果实为试材,在4℃(低温组),相对湿度85%~95%条件下贮藏,研究基于气味判别草莓新鲜度的方法。分别运用电子鼻和单一乙醇传感器采集草莓贮藏期间的气味。主成分分析结合感官评定将草莓的新鲜度划分为4个阶段,分别为4℃贮藏0~3,6,9~12,15d。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和分类型支持向量机(SVM-C)构建了基于气味判别草莓新鲜度的模型;应用电子鼻和PLS-DA法构建模型,建模组和验证组总体准确率分别为84.2%,88.3%;而基于SVM-C法构建模型,建模组和验证组总体准确率分别为99.2%,96.7%。应用乙醇传感器技术和PLSDA法、SVM-C法构建模型,准确率分别为83.3%(PLS-DA法建模组),86.7%(PLS-DA法验证组),90.8%(SVM-C建模组),90.0%(SVM-C验证组)。该研究可为建立草莓采后贮藏和流通过程中新鲜度实时监测的方法提供技术参考。     

海藻酸钠固定化果胶酶的研究

以海藻酸钠为载体,采用交联吸附法固定果胶酶。通过单因素实验和正交实验考察固定化主要因素对固定化酶活力的影响,优化固定条件。结果表明,在海藻酸钠浓度为2%、氯化钙为1%、戊二醛浓度为3%的条件下,采用酶浓度为0.2mg/mL、pH值3.0、温度为40℃、固定时间为45min。固定化果胶酶活力最高,酶活回收率达到84.4%。     

果胶酶在壳聚糖上的固定化研究

本文以壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，研究了果胶酶的固定化，分析了戊二醛浓度、给酶量、温度对酶固定化的影响。同时对固定化后的酶促作用条件（最适pH、温度）、米氏常数、半衰期等理化性质进行了初步测定，结果表明，在3％戊二醛，0．1mg/g湿壳聚糖的给酶量，5℃条件下，果胶酶固定化的固定率较高。酶促特性研究表明，固定化果胶酶最适温度范围较非固定化果胶酶大，最适pH和表观Km均有所下降，在4℃条件下,固定化果胶酶的半衰期约为30d。     

转谷氨酰胺酶的膜固定化研究

以臭氧活化后的聚丙烯微孔膜为载体,并以丙烯酸为单体、戊二醛为交联剂固定转谷氨酰胺酶。研究了臭氧活化时间、接枝反应时间、温度、单体浓度、莫尔盐浓度对接枝率的影响,并对固定化条件进行研究。确定了最佳固定化条件为：己二胺浓度15%,胺烷基化温度50℃、时间120min,戊二醛浓度3%,交联温度30℃、45min,酶浓度10mg/mL,固定化时间20h。此条件下载酶量为30.23mg/g膜,酶活力可达16.9U/g膜。     

谷氨酸发酵液对谷氨酸提取工艺影响研究

主要研究了谷氨酸发酵液对谷氨酸提取工艺的影响,得出如下结论:用膜过滤除菌方法对染菌发酵液有较好的提取效果;发酵周期控制在30～34h;发酵液放罐残糖控制在0.6%以下;发酵结束后要及时升温处理,升温至65℃.     

普洱茶对a-淀粉酶抑制作用的影响研究

通过对不同年代普洱茶、不同产地的普洱茶原料、不同产地的普洱茶出堆样的活性成分进行提取,测定其对α-淀粉酶的抑制作用的影响.结果表明,不同年代的普洱茶中,以贮藏时间15-18年的普洱茶样品(S-6、S-7)对α-淀粉酶的抑制作用最为显著,其值分别高达50.00%和54.63%;不同产地的普洱茶原料中,以勐海、临沧的普洱茶样品(S-5、S-6)的抑制作用最强,其值分别高达50.92%和50.73%;不同产地的普洱茶出堆样中,以临沧的普洱茶样品(S-6)的抑制率稍高,其抑制率为23.17%.可见,不同原料的普洱茶对α-淀粉酶的抑制作用是不同的.其中以不同年代的普洱茶中样品S-6、S-7和在不同产地的普洱茶中样品S-5、S-6对α-淀粉酶的抑制作用较强.     

冷冻保藏对鸡肉保鲜效果的研究

主要研究鲜鸡肉在-18℃下冷冻保鲜过程中的肉品质的变化。通过对肉样色差值、菌落总数、理化指标(pH值、TVB-N)的测定和比较分析,探讨鲜鸡肉在冻藏条件下肉品质的变化情况。结果表明:随着贮藏时间的增加,各项理化指标和细菌总数均呈现先下降后上升的趋势;随着储藏期的延长,色差L*值呈下降趋势,而a*值呈上升趋势;经过90d冻藏,鸡肉还是二级鲜度。     

浅析自动络筒机对细纱毛羽的影响

基于络筒工序细纱管纱高速退绕因自身摩擦、纱线张力的影响使纱线毛羽增加的现状,提出在自动络筒机上加装气圈控制器或加装PERLA-A型涡流毛羽减少装置,不仅将使毛羽明显减少,还可提高纱线强力,并具有其它积极效果。通过在相同工艺条件下自动络筒机加工同号数紧密纱与普通纱的不同毛羽增加情况对比,分析认为产生毛羽的根源是细纱工序,并非是自动络筒机加工的原因。