不同地理漆树种源的遗传多样性AFLP分析

为了探索不同区域与海拔漆树种源遗传多样性及相关性,利用AFLP分子标记技术对源于陕西、四川、重庆、湖北四省市的70个不同种源漆树样本进行了遗传多样性分析。从64对Pst I+3/Mse I+3引物组合中,筛选出8对引物,用于扩增基因组DNA,共获得27831条清晰可见的标记,其中多态性标记有26545条,多态性检出率95.38%。所有样本的的遗传距离在0.191~0.995之间,相似性为0.741~0.917。海拔不同的11个样本的遗传距离为0.219~0.468,相似性为0.828~0.915。UPGMA聚类结果显示漆树种群与海拔标高的相关性不明显,但是与区域联系紧密。同一区域的漆树种群在分子水平上较相似,趋向于聚为一簇,邻近区域的种群也有较大相似性。     

基于EST-SSR分子标记的狼毒大戟资源遗传多样性分析

以采自黑龙江省内的9个狼毒大戟资源为材料,利用SSR分子标记技术对9份资源的遗传多样性进行分析。结果表明:在50对引物中共筛选出26对多态性引物,扩增出52条带,均为多态性条带。样品之间的遗传相似系数为0.5192～0.9423之间,表明供试样品在分子水平上存在较大的变异幅度。所有样品均可分开,也说明SSR分子标记的有效性。     

快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增技术的建立

目的建立快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,探讨其用于淋球菌感染早期诊断的可行性。方法利用Primer-ExplorerV3软件分别针对淋球菌porA及16S rRNA基因设计6条引物(2条内引物FIP、BIP,2条外引物F3、B3,2条环引物LF、LB),以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,同时,以外引物F3、B3为PCR引物,进行PCR扩增,并比较2种扩增方法的灵敏度和特异性。结果LAMP法与PCR法灵敏度相同,可检测到10个拷贝的目的基因;其针对淋球菌porA和16S rRNA基因的引物对脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌的DNA均不能扩增。结论已成功建立了检测淋球菌porA和16S rRNA基因的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法。     

河东乌麦低分子量谷蛋白基因的生物信息学分析

低分子量谷蛋白是一种重要的贮藏蛋白质。它对小麦的加工品质有重大影响,尤其在面点制作过程中具有较大作用。本研究通过提取纯化河东乌麦总基因组DNA,利用特异引物进行扩增,扩增产物经回收纯化后送生物公司测序。生物信息学软件分析发现,得到1条长度为918bp的低分子量谷蛋白编码基因序列,其上共有18个酶切位点,GC含量为49.0%。该基因与来自于普通小麦低分子量麦谷蛋白得亚基GluA3-21和GluA3-1基因相似值达到99%。该基因编码306个氨基酸,分子量大小为34588.0kDa,信号肽序列为MKTFLVFALLAVVATSAIA。Gln谷氨酰胺含量最高,为35.00%,二级结构主要为无规则卷曲结构组成,其次为片层结构。本研究结果可为低分子量谷蛋白与小麦面粉加工品质关系提供参考。     

吉林省汉坦病毒宿主动物携带病毒的遗传进化分析

目的对吉林省汉坦病毒(Hantavirus,HV)宿主动物携带病毒进行遗传进化分析。方法采集吉林省不同地区鼠肺样品,应用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定出HV感染的阳性样本,利用Trizol试剂提取病毒RNA,RT-PCR法扩增阳性样本中M和S片段基因,并进行测序,应用DNASTAR软件对M和S片段基因的核苷酸同源性进行分析,并与汉城病毒(Seoul virus,SEOV)参考株进行比较;利用MegAligh软件进行蛋白序列中氨基酸差异性分析;利用MEGA 5.0软件进行系统发生分析。结果共捕获719只啮齿动物,其中褐家鼠(R.norvegicus)555只,黑线姬鼠(A.agrarius)74只,小家鼠(M.musculus)90只,HV抗原阳性率为1.39%(10/719);10份阳性样本中,7份来自褐家鼠,2份来自小家鼠,1份来自黑线姬鼠。用全长S引物扩增得到的10株病毒全长S基因片段,经同源性分析比较发现,各序列间的核苷酸同源性在92.8%~95.1%之间,与其他SEOV核苷酸同源性在90.2%~94.7%之间;用M引物扩增得到的部分基因片段,经同源性分析比较发现,各序列间的核苷酸同源性在96.5%~99.5%之间,而与其他SEOV核苷酸同源性在91.5%~97.7%之间;10株病毒全部属于SEOV。黑线姬鼠G蛋白365~769位点间有5个氨基酸差异位点(V494L、C546S、Y626C、M630L和V637I),小家鼠G蛋白365~769位点间主要有5个氨基酸差异位点(C378G/R、F420L、Q436P/R、E535G/A和C589G/W),但同种间在378、436、535和589位点也有差异;黑线姬鼠N蛋白1~430位点间存在P298L变异;小家鼠N蛋白变异位点较多,主要在M24K/N、A37D、I140M、M173K、D192E、L219V、P229A、D237E、H265Y、V284L、T333S、A389G和V425E变异。分离得到的10株病毒根据不同的来源地可分为两个不同的进化分支。结论研究表明吉林省宿主动物携带的HV仍以SEOV为主,其遗传进化呈现多样性。     

低温脂肪酶产生菌Trichosporon pullulans的脂肪酶基因克隆

以产低温脂肪酶菌株5-1为材料,用酶法和CTAB法分别提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测亮带进行比较,结果表明用CTAB法提取的DNA的完整性更好、浓度更高;该菌株通过18SrDNA基因鉴定,即以待检菌株提取的DNA为模板,以18SF、18SR为引物,进行PCR扩增,由18SrRNA的保守序列分析,鉴定为Trichosporon pullu-lans茁芽丝孢酵母属;利用脂肪酶的同源基因片段来设计引物,以该菌株的DNA为模板,进行PCR筛选,克隆脂肪酶基因;并对模板量、退火温度两个重要因素进行优化,初步确定最佳PCR扩增条件为：模板量为DNA原液,退火温度为55～45℃梯度降低。     

白细胞介素-6基因启动子区-572位点多态性与EV71感染疾病严重程度的相关性分析

目的探讨白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)基因启动子区-572位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与儿童肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染疾病严重程度的相关性。方法提取87份EV71重症感染患者和57份无症状隐性感染儿童血液样本基因组DNA,进行PCR扩增及测序,检测IL-6基因启动子区-572位点多态性,利用Logistic回归分析基因型频率。结果 EV71重症感染患者IL-6基因型频率与对照组相比,差异有统计学意义(OR=2.605,95%CI:1.117~6.074,P=0.027)。IL-6多态性与EV71感染严重程度有关(OR=2.411,95%CI:1.236~4.706,P=0.010)。结论 IL-6多态性与中国儿童EV71重症感染可能具有相关性,对确定影响疾病严重程度的宿主遗传因素和增强治疗效果具有重要意义。     

漆树过氧化物酶同工酶遗传变异的研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳对31个四川漆树品种作过氧化物酶(P_x)同工酶分析。从252个样本的P_x 同工酶标本中分析出漆树 P_x 同工酶的八种基本谱型。经 x~2检验各谱型中最稳定的一级特征带推测是分别由一对等位基因控制,且这两对等位基因间无连锁关系。同一无性系植株谱型一致,可利用 P_x 同工酶作无性系鉴定的生化指标。各品种内谱型有变异。     

乙型肝炎病毒DNA定量检测室内质控品的制备及效果评价

目的制备乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA定量检测室内质控品,并进行初步评价。方法对HBV各个基因型序列进行多序列比对分析,选择保守序列S区设计引物,PCR扩增HBV S区基因,与pEASY-T1载体连接,构建重组质粒。测序后,将重组质粒稀释成10~7 copies/ml、10~4 copies/ml两个水平,分别作为高值质控品(HBVH)和低值质控品(HBV-L),分装冷冻于-80℃,并初定靶值。评价自制质控品的精密度和稳定性,绘制室内质控图。结果构建的重组质粒测序结果与目的片段一致,自制HBV DNA 2个水平室内质控品的精密度、稳定性均达到实验要求。结论自制HBV DNA 2个水平的质控品可用于HBV DNA定量检测的室内质控。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性

目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压(EH)的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例(EH组)和体检正常的女性119例(正常对照组),提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解(HRM)法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率(分别为26.8%、53.5%和19.7%)与正常对照组(分别为27.7%、42.0%和30.3%)比较,差异均无统计学意义;等位基因频率(A:53.5%;G:46.5%)与正常对照组(A:48.7%;G:51.3%)比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。     

大肠埃希菌O157:H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用

目的建立一种能够满足现场快速检测、完全脱离实验室仪器设备的大肠埃希菌O157∶H7多重PCR检测方法。方法利用大肠埃希菌O157∶H7抗原基因保守序列fli Ch7和rfb E设计2对引物,并对Palm PCR G1-12退火温度、循环数、引物浓度及引物最佳比例进行优化,建立微量快速检测大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行验证。取疑似病牛粪便共9份,利用粪便DNA提取试剂盒提取DNA,按照建立的PCR方法进行扩增,扩增产物经微型电泳仪电泳检测并照相。结果确定大肠埃希菌O157∶H7 PCR的最佳退火温度为54℃,循环数为25个循环,上下游引物浓度为10μmol/L,2对引物最适比为fli Ch7∶rfb E=1∶3。大肠埃希菌O157∶H7扩增产物可见625 bp(fli Ch7)和213 bp(rfb E)的特异性片段,而大肠埃希菌(ATCC25922)、猪链球菌2型、金黄葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、小肠耶尔森菌、单增李斯特菌、沙门菌的PCR检测结果均为阴性,最低扩增DNA浓度为10 pg/μl,重复扩增5次均可见目的条带。9份疑似病牛粪便样品中,共检测出7份大肠埃希菌O157∶H7阳性样品。结论建立了大肠埃希菌O157∶H7微量快速多重PCR检测方法,该方法特异性、灵敏性和重复性均良好,可在现场约1 h报告结果,对突发性传染病的防治具有重要意义。     

利用高静水压技术提高黏红酵母生物合成β-胡萝卜素的产量

利用100~500MPa的高静水压和10~30min的保压时间对黏红酵母(Rh.glutinisRG5)进行处理,发现处理10min时的高压存活曲线呈现马鞍形,说明高静水压处理的最终效应可能是多种生物学效应的累积。在250MPa处理10min所获得的高压突变株RG5-3,其生物量虽然比出发菌株RG5下降了9.25%,但目的产物β-胡萝卜素的含量却比RG5提高了68.60%。传代实验表明该诱变株遗传稳定性良好,没有发生性状退化及回复突变。利用限制性片段长度多态性分析(RFLP)比较发现,限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ切割的RG5和RG5-3的DNA片段有明显不同,初步证明高静水压使黏红酵母RG5在表面性状和DNA水平上都发生了改变。     

保健食品中3种病原菌多重PCR快速检测方法的建立及验证

目的建立快速检测保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR(multiplex PCR,m PCR)方法,并进行验证及初步应用。方法以提取的各菌株基因组DNA为模板,利用Gen Bank中登录的沙门菌inv A、志贺菌ipa H、金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物,采用优化后的反应体系及确定的反应条件进行PCR扩增,扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,对建立的方法进行特异性、敏感性、重复性验证。将沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌等量混合后,进行10倍系列稀释,加至10批无病原菌蛋白质粉和10批无病原菌减肥茶样品匀浆中,用建立的方法进行PCR扩增,并与GB常规生化检测结果进行比较。结果确定m PCR反应体系为:10×PCR buffer 2.0μl,d NTPs 2.5μl,Taq DNA酶0.6μl,上下游引物各1.5μl,Mg2+1.0μl,补加dd H2O至25μl。10株细菌中,沙门菌、2株志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增结果为阳性,其他菌株为阴性,inv A、ipa H、nuc基因扩增片段与Gen Bank登录的序列同源性分别为99%、99%和100%;沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌菌株均能在101~105 CFU/ml浓度时扩增出特异性目的条带;5个浓度混合菌液扩增产物均可见特异性反应条带。该方法扩增出10批人工添加细菌蛋白质粉和10批人工添加细菌减肥茶中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的特异性基因片段,检出限均为102 CFU/ml,与GB常规生化检测结果一致。结论建立的保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌m PCR检测方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可满足不同检验机构快速、准确检测保健食品中多种病原微生物样品的实际需要。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

环江地区延安组延8砂体特征及储层物性研究

环江地区横跨鄂尔多斯盆地中西部天环凹陷和西缘逆冲带,具有巨大的工业石油开采潜在价值。本文主要基于岩心、薄片等相关资料,开展砂体的特征与储层物性研究,认为该区的砂体在平面上呈条带状分布,南北方向的砂体连通性好,东西方向连通性差。储层孔隙度主要集中在10%~20%之间,渗透率主要集中于1~10×10-3μm2之间。     

长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫感染的分子流行病学调查

目的调查长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染的分子流行病学特征。方法选择长春地区两个猪场,随机采集60份猪粪便样品,根据贾第虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TPI)基因设计巢式PCR引物,以提取的猪粪便基因组DNA为模板进行巢式PCR扩增,PCR产物经测序及序列比对,并建立贾第虫系统进化树。结果 60份样品中,27份为阳性,阳性率为45%(27/60),基因型均为人兽共患型集聚体A。结论长春地区两个猪场存在较严重的贾第虫感染,基因型均为集聚体A,有较大的散播风险,需加强猪场卫生监督管理,以避免疫病流行。     

磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量

目的利用磁珠分离法结合定量PCR技术,建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证,并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定。结果该方法检测CHO细胞DNA残留的最低准确定量浓度可达1×10-3 pg/μl,DNA含量在1×10-3~102 pg/μl范围内曲线线性良好,标准曲线的相关系数为0.994;该方法能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属的DNA无扩增反应;该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在90%以上,3次测定的相对标准偏差均小于20%,92.6%加标样品的DNA回收率在70%~130%之间;该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100 pg/剂量,符合《中国药典》三部(2010版)有关CHO细胞残余DNA的要求。结论磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定。     

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值0.1,R~2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。     

分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因特征及差异分析

目的比较2株分离自手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)和疱疹性咽峡炎(herpangina,HA)患者粪便样品中的柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)全基因组差异及基因特征,探讨基因突变可能导致的临床症状差异。方法收集昆明市儿童医院经实时荧光定量PCR检测结果为CA10阳性的HFMD及HA患者粪便样品,在敏感细胞人横纹肌瘤细胞(rhabdomyoma,RD)上培养并分离出CA10。设计特异性引物扩增获得CA10全基因序列,通过BioEdit软件比较分离自HFMD及HA患者的CA10基因序列核苷酸与编码氨基酸之间的差异。从NCBI基因库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载CA10 VP1基因序列作为参考序列,系统进化树分析分离获得的昆明CA10流行株的进化情况及来源。结果分离自HFMD和HA患者的CA10-HFMD和CA10-HA的VP1区域核苷酸同源性为99. 1%,氨基酸同源性为99. 8%,且存在2个非同义突变位点;全基因序列核苷酸同源性为98. 9%,编码区氨基酸同源性为99. 5%,且存在12个非同义突变位点。系统进化分析表明2个昆明CA10分离株均位于G基因谱系,且与KF999765(北京)和JX473455(深圳)株亲缘关系最近。结论来源于HFMD和HA患者的CA10分离株在核苷酸和氨基酸水平上相似性较高,且属于同一基因谱系。基因突变导致的氨基酸变异可能影响病毒的毒力从而导致患者症状的差异。     

中国漆树资源研究及精细化应用

中国是漆树(Toxicodendron verniciflua Stokes.)的原产地。早在7000多年前,中国先民就已经利用从漆树皮层采割的生漆髹涂器具,装饰工艺品,形成了东方优秀的传统文化遗产。漆树在中国的水平分布范围,约相当于北纬25~41°46,东经约在95°30′~125°25′之间,东西约1500km,南北约900km,包括了中国24个省(市)、区,500多个县;漆树在中国山地的垂直分布幅度,一般分布在海拔100~3000m之间,以400~2000m分布最多;秦巴山地、鄂西高原和大娄山、乌蒙山一带,环绕四川盆地东侧是其分布中心,群集度和常见度高,约相当于北纬26°34′~34°29′,东经103°53′~112°10′之间,在这个区域以外,向东、向西、向南、向北漆树分布逐渐减少。漆树最适栽培区的年均温在14℃左右,≥10℃积温在4000℃以上,1月份均温在2℃以上,年降水量在700mm以上。年雨量少于550mm的地区,或年平均气温超过20℃以上的地区,很少有漆树的自然分布。漆树雌雄异株,变异类型品种多,在中国有100多个品种,其中有46个优良品种、14个特优品种,主要通过无性系扩繁技术繁育,每年的7~10月份是中国生漆的采割季节。漆树乳汁道来源于原形成层细胞发育,裂生起源,遍布漆树体的各类器官内,其中多数存在于微管系统的韧皮部中,并以茎干的次生韧皮部为最多,是生漆分泌和贮藏的场所。生漆成分在细胞中的合成作用主要在质体和内质网中进行,细胞核、线粒体、高尔基体以及细胞质基质或多或少参与了生漆的合成或细胞内运输。生漆中的各种成分及含量随气象因子、漆树品种、生长环境、割漆时间和采割技术等的不同而有所差异。生漆除了直接用于器具的髹涂、防护、保护外,其漆酚、漆酶、漆多糖、糖蛋白等均可以进行精细化应用,开发功能高分子材料、生物活性成分和生物质能产品,应用前景宽阔。