AFP与OEA基因的启动子克隆及肿瘤细胞特异性表达的研究

为了研究AFP和CEA基因启：功子的转录活性与肿瘤特异性,本实验利用PCR技术扩增AFP和CEA基因上游序列,并将其克隆到pGL3-Basic载体中构建pGL3-AFP和pGL3-CEA荧光报告质粒。将构建的pGL3-AFP和pGL3-CEA质粒分别与pRL-TK共转染人结肠癌细胞株SW620、肝癌细胞株Huh-7、肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela、人肝正常细胞株QSG7701、人肺正常细胞株Beas-2b,用双荧光报告系统检测这两种质粒在不同细胞里的荧光活性表达。酶切和测序结果证实成功构建了双荧光素酶报告质粒pGL3-AFP和pGL3-CEA,双荧光素酶报告基因检测结果证明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性。这些结果表明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性,为进一步研究AFP和CEA基因的表达调控机制和探讨靶向基因-病毒治疗提供依据。     

小鼠sox2基因的克隆及其原核表达载体构建

TAT穿膜肽能携带大分子物质进入细胞。NLS核定位信号肽是能帮助亲核蛋白进入细胞核的短肽。SoxB1家族的SOX2是维持ES细胞全能性的重要转录因子。通过RT-PCR方法从小鼠胚胎干细胞中克隆得到小鼠sox2基因,将其与穿膜肽基因tat和核定位信号基因nls融合,利用原核表达载体进行融合蛋白表达,并将表达的蛋白纯化、复性得到复性蛋白,为今后对SOX2蛋白的功能及生物学活性展开研究奠定了基础。     

Survivin启动子介导的溶瘤腺病毒载体抗肿瘤研究

肿瘤特异性启动子用于调控溶瘤腺病毒载体靶向于肿瘤细胞,从而实现对肿瘤组织的特异性杀伤,肿瘤特异性启动子的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略.利用肿瘤靶向人源Survivin 启动子构建的重组腺病毒Ad.SP-E1A展开对多种肿瘤细胞和正常细胞杀伤实验研究,结果发现:Ad.SP-E1A具有较高的肿瘤靶向杀伤能力以及对正常细胞无毒副作用,为基因病毒治疗平台中选择高效安全的腺病毒载体提供参考.     

果实特异性启动子驱动丙型肝炎病毒E2基因植物表达载体的构建

构建了果实特异性启动子驱动的含编码丙型肝炎病毒包膜蛋白E2基因的植物表达载体,为研制有效的转基因植物丙肝疫苗打下基础。以载体pCAMBIA2300为骨架引入pBIl21中的GUS基因,用目的片段E2基因替换其中的GUS基因构建了pCAM-BIA2300G-E2载体,将番茄的果实特异性启动子E8引入pCAMBIA2300G-E2载体中构建了pE8-E2植物表达载体。用限制性内切酶消化重组载体,结果表明重组载体都含有所插入的目的片段。果实特异性启动子驱动的含E2基因的植物表达载体的成功构建,为抗丙型肝炎病毒的口服疫苗研究提供了试验基础。     

GPC-3与AFP单项及联合检测对HCC诊断价值的Meta分析

本文利用Meta分析探讨GPC-3、AFP单项检测及GPC-3+AFP联合检测对原发性肝细胞肝癌的诊断价值.在PubMed、Web of Science和Elsevier等三大数据库中按照纳入排除标准筛选文献,用QUADAS-2评价纳入的文献,并运用Meta-Disc 1.4、Stata 12.0和Review Man...     

地衣芽孢杆菌sipS基因的强启动子的克隆与鉴定

通过基因打靶的方法,利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体,从地衣芽孢杆菌ATCC 14580菌株基因组文库得到一个强度较高的启动子的克隆子P111509,克隆子P111509在大肠杆菌DH5α中所表达的β-半乳糖苷酶酶活有1290 miller单位,在枯草杆菌1A747中有3332 miller单位.将P111509基因启动子片断测序后与地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组序列进行同源性分析,二者同源性达到100%,且具有地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因启动子的保守序列.     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

家蚕BmLITAF基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕蛹cDNA文库进行分析时,发现一条与脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子LITAF的保守结构域同源的保守序列。基因序列全长为981 bp,由97 bp的5端非翻译区序列(5 UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3端非翻译区序列(3 UTR)组成。利用生物信息学方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸残基;其预测理论分子量为13.9 kDa,预测等电点6.47;在90~100位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,具有跨膜结构域;定位细胞内的可能性较大。根据BmLI-TAF的cDNA序列进行PCR扩增获得目的基因,将其克隆到质粒pGEX-4T-3中,测序验证克隆正确。经IPTG诱导,结果发现目的蛋白主要以包涵体的形式存在。     

家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

番茄果实特异性启动子驱动下的乙肝表面抗原S基因的植物表达载体的构建

将番茄果实特异性启动子通过PCR的方法扩增出来,然后将其替代了pBIN438的CaMV35S启动子,并将乙肝表面抗原的S基因连接到载体上,以获得番茄果实特异性表达乙肝表面抗原的高效植物表达载体。     

云南宾川脐橙蔗糖转运基因的克隆和表达分析

蔗糖不仅是植物光合作用的主要产物,也是植物体内运输的主要物质和许多果实中糖积累的主要形式,对果实品质的形成有重要影响.在蔗糖合成的路径中,蔗糖合成酶(Sucrose Synthase)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate Synthase)是蔗糖代谢的关键酶.在前人报道苹果蔗糖转运基因的基础上,对云南宾川脐橙蔗糖转运基因进行克隆和表达分析,并对其相关的生理生化指标(蔗糖等糖含量、蔗糖合成代谢相关酶活性等)进行测定.研究结果显示,在宾川脐橙果实接近成熟时蔗糖转运基因的表达量最高,成熟脐橙中果肉的蔗糖含量比果皮中高,而成熟脐橙果肉和果皮中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性差异不显著.     

一种新型琼胶酶AgaB的基因克隆及生物信息学分析

利用从青岛近海发现的一株高产琼胶酶的假别单胞菌CY24(Pseudoaltero-monassp.CY24)建立基因组DNA文库后,用水解圈的方法从中筛选到一个具有琼胶酶活性的阳性克隆pBA1。pBA1的序列分析结果表明,插入DNA片段的长度为6.7 kb,含有4个推测读码框架,并利用亚克隆法确定了琼胶酶的编码基因agaB。agaB基因的开放阅读框架为1 437 bp,编码478个氨基酸,理论分子量为50.9 kDa,在N末端有一个包含38个氨基酸的信号肽。推测的成熟蛋白质的分子量和等电点分别为47.2 kDa和4.83。AgaB的氨基酸序列与已知蛋白质包括所有的糖苷水解酶序列完全没有相似性;HCA的蛋白质二级结构分析结果表明,AgaB不同于其他已知琼胶酶。因此,推测AgaB为一新型的琼胶酶,代表一个新的糖苷水解酶家族。     

胞内分枝杆菌HSP 70基因的克隆、分析及原核表达

胞内分枝杆菌为致病性非结核分枝杆菌（NTM）之一,分布广泛,人畜均可感染,对人畜健康造成极大威胁。应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HSP 70基因,利用在线分析软件对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体p ET15b-HSP 70,同时进行诱导表达。结果显示,胞内分枝杆菌HSP 70基因完整,ORF基因全长1860bp,共编码619个氨基酸,HSP 70为酸性、亲水性蛋白质,不存在明显跨膜结构,含14个潜在磷酸化位点,亚细胞定位主要存在于细胞质中,无信号肽结构。二级结构预测,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。同时,以同源建模法预测了HSP 70基因编码蛋白的三维立体结构。成功构建p ET 15b-HSP 70原核表达载体,在原核表达系统中该载体可诱导表达70ku的HSP70重组蛋白。     

基于SVM的灵敏度分析方法选取肿瘤特征基因

提出基于支持向量机的灵敏度分析方法选取结肠癌特征基因.用支持向量机分析基因对分类决策函数的灵敏度,递归去除灵敏度较低的若干基因,得到一组候选特征基因子集;以支持向量机为分类工具,检验候选特征基因子集对样本分类的贡献,选取具有最佳分类能力的候选特征基因子集作为结肠癌特征基因子集.通过实验比较,该特征基因子集的分类能力优于文献给出的其他特征基因子集,表明了该方法的可行性和有效性.     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

25CrMnMoTi钢的多次冲击特性及数学解析

用数学方法分析了２５ＣｒＭｎＭｏＴｉ钢的多次冲击抗力特性，获得了多次冲击敏感指数的变化趋势，求出了多次冲击抗力包络线方程及寿命峰值和抗力峰值转移规律方程，Ａ－Ｎ－ＨＲＣ三元方程可作为工程设计的参考．     

携带socs3基因的溶瘤腺病毒的构建及体外抗肿瘤活性的研究

SOCS3（suppressor of cytokine signaling 3）是JAK/STAT信号通路的负调控因子,SOCS3间接调控的STAT3磷酸化与肿瘤的发生密切相关。本试验构建携带socs3的溶瘤腺病毒AdCN305-SOCS3,在细胞水平研究socs3对肿瘤的抑制作用,并评估AdCN305-SOCS3的抗肿瘤效果。该病毒感染多种肿瘤细胞,均能特异性扩增,同时表达功能正常的SOCS3蛋白,从而抑制STAT3磷酸化,引起肿瘤细胞的明显凋亡。对AdCN305-SOCS3的研究,证实SOCS3蛋白和AdCN305-SOCS3病毒都具有抗肿瘤的功能,在肿瘤的靶向基因治疗研究中具有广阔的应用前景。     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及在酵母中的表达

本实验从构建于大肠杆菌DH5α的瑞氏木霉cDNA文库中用PCR法体外扩增到木聚糖酶I（XynI)的DNA片段，然后连接至穿梭载体pAJ401,转化酵母H158,以刚果红染色法筛选阳性重组子并测序，当将其mRNA5‘端非翻译区的79个碱基删除后，木聚糖酶的表达水平显著提高，有可能此基因的调节区位于5‘端非翻译区内，而且可能被酵母的相关基因表达因子所识别。     

西施舌16S rRNA基因片段PCR扩增及其核苷酸序列分析

利用酚/氯仿抽提法提取了西施舌闭壳肌总DNA,以总DNA为模板,利用两条16S rRNA基因特异引物,进行PCR扩增,扩增产物测序后进行序列分析。结果从西施舌的闭壳肌提取得到总DNA,获得一个长度约300 bp的PCR扩增产物;测序结果显示此片段为294 bp;核苷酸序列经WU-blast2分析,与Spisula subtruncata(AJ548774)和Corbicula sp(AY097259)的16S rRNA的同源性均为74%。经DNAStar分析,此核苷酸序列A,G,T,C含量分别为35.74%,25.51%,26.19%和13.59%,A T(61.90%)含量明显高于G C(38.10%)含量。