水稻端粒酶RNA候选序列的鉴定

端粒酶由端粒酶反转录蛋白和端粒酶RNA构成,端粒酶RNA中除模板序列保守外,其余区域的保守度极低,难以基于同源序列实施克隆。目前,植物中仅拟南芥端粒酶RNA得到了克隆。为了鉴定一条具水稻端粒酶RNA特征的候选序列,研究中进行了对模板序列单碱基T/A突变(5′-AAACCCTAA-3′)后的转基因愈伤组织端粒酶活性的比较,结果显示在缺乏dATP的端粒重复序列扩增法反应中,突变型的端粒酶活性明显高于未突变型;对体外延伸得到的端粒ssDNA进行测序分析,结果发现所测10条片段均含有突变特征序列;再对转基因植株进行端粒序列的检测,结果所测8个端粒序列中,有2个含有突变特征序列。因此,初步判断该候选序列为水稻端粒酶RNA基因。     

人端粒酶RNA突变对HeLa细胞作用

端粒存在于真核生物染色体末端,由特定的DNA重复序列及与之特异性结合的蛋白质构成。在正常人体细胞中,每一次细胞分裂,由于DNA复制时的方向必须是从5’到3’端,因而伴随着染色体末端的端粒逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时,细胞开始走向凋亡。同时,端粒能在端粒酶作用下延伸,利用自身的RNA为模板合成端粒DNA。文章通过突变端粒酶RNA靠近模板的序列碱基A^61 A^62／GG以及G^63 G^64／AA,构建穿梭质粒,转染HeLa细胞,研究端粒酶位点突变对细胞生长的影响。研究结果显示不同的突变位点对HeLa细胞分裂活性有明显影响,这为深入研究肿瘤的分子遗传机制提供参考。     

水稻端粒酶RNA模板基因序列鉴定体系的建立

利用水稻端粒酶对端粒序列的合成作用,对模板基因序列进行定点突变,构建了pCambia1301-T突变型、pCambia 1301-Y野生型载体.经农杆菌介导,选用水稻不同品种和组织,探索候选序列的鉴定体系.结果显示,不同水稻品种诱导愈伤,差异显著,其中中花11号可快速诱导愈伤,比广陆矮4诱导时间缩短一半,用成熟胚和幼胚分别诱导愈伤,无明显差异;对突变型、野生型、正常组织进行基因组DNA端粒鉴定和端粒酶活性分析,发现突变型端粒酶活性明显高于对照.这些均表明该鉴定体系完整、可靠,为端粒酶RNA模板基因序列的鉴定建立了有效的方法.     

水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征解析

端粒酶是由端粒酶反转录酶和端粒酶RNA构成,端粒酶RNA中含有端粒合成所需的模板序列.现仅获得了拟南芥的端粒酶RNA序列.为了建立快速有效的富集植物端粒酶的方法并克隆水稻的端粒酶RNA序列,研究中使用不同浓度的PEG6000选择性的沉淀端粒酶萃取液中的杂蛋白.结果表明当PEG6000浓度为4％时,端粒酶活力最高,并可以有效降低核糖体28S rRNA和18S rRNA的干扰.从端粒酶蛋白液中提取RNA,并在其3′端连接接头,在模板区设计上游引物,PCR扩增获得一条292 bp的未知片段,其中含有端粒模板序列5'-AAACCCTAA-3′.将该片段及拟南芥端粒酶RNA的转录调控区进行序列比对分析发现,两者具有类似的转录调控元件.因此,初步判定292bp的目的片段为水稻端粒酶RNA的模板下游序列.     

西兰花端粒酶分离与活性测定探究

植物端粒酶以自身的RNA亚基为模板，维持着染色体末端端粒的长度，从而使植物细胞可持续分裂。本研究以西兰花花蕾为材料，采用不同分子量、不同浓度的PEG分别提取端粒酶，根据PEG吸附蛋白质的原理，从具有端粒酶活性的组织中分离并富集端粒酶。结果显示：用PEG6000提取西兰花端粒酶，且用100μg的酶量进行酶促反应时测得的端粒酶活性最高。以此为参数，经改进的TRAP法成功检测到：用0．2g PEG6000／700μL洗脱液提取出的端粒酶活性很高。这些分离、检测技术为其它植物组织中端粒酶活性的检测和评价提供了新的途径，尤其对低活性的植物端粒酶检测具有重要意义，为深入研究端粒酶RNA的序列及结构奠定了基础。     

水稻单个端粒长度定量测定及分析

端粒是真核生物线性染色体末端的特殊结构,一定长度的端粒在维持真核生物遗传信息完整性和染色体结构稳定性中起重要作用.建立一种简单快捷定量测定水稻单个端粒绝对长度的方法对研究水稻各个染色体端粒具有积极的意义.研究将特殊接头连接到水稻染色体端粒的G-overhang末端,并利用近端粒区域的特定引物以及下游接头引物,通过PCR技术,获得所需鉴定的端粒,结合DNA凝胶电泳成像分析系统,定量检测水稻单个端粒的长度.结果显示本方法可以通过少量水稻基因组DNA有效测定单个端的粒长度.     

影响RNA芯片探针杂交效率的因素分析

RNA芯片作为研究ncRNA的主要技术之一,已受到广泛关注。然而因RNA芯片中靶序列的单链特征,使得RNA芯片的探针设计比DNA复杂。本研究对加强型绿色荧光蛋白（EGFP）RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作了RNA原位合成芯片,研究探针／靶序列杂交双链△G和Tm、靶序列二级结构以及探针的末端碱基对RNA芯片杂交信号强度的影响。结果表明,探针／靶序列杂交双链△G和Tm相同的探针间的杂交信号存在较大差异,探针／靶序列杂交双链△G和,Tm与RNA芯片杂交信号之间未发现明显的规律性;靶序列二级结构的探针PT-sc参数与芯片杂交信号强度间呈较好的线性关系;探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号强度也有影响,5’末端碱基为6／C的探针杂交信号总体上高于其邻近的5’末端碱基为A／T的探针的杂交信号,为RNA芯片的探针筛选提供一定的理论基础。     

具抗肿瘤活性的G-四链体核酸研究进展

G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含串联重复的鸟嘌呤碱基(G)的DNA或RNA链折叠形成的一种特殊的核酸二级结构.可形成G4结构的核酸序列在基因组和人端粒中广泛存在,对生理和病理过程起重要的调节作用.近年来研究发现,一些化学合成的G4核酸具有选择性的抗肿瘤增殖活性;其中AS1411是一个26个碱基的G4序列核酸,目前已作为抗癌药物进入二期临床研究.对G4核酸的结构和功能,抗癌活性及分子机理研究进行综合评述,并简要介绍G4核酸在相关领域的应用研究.     

阴离子卟啉对DNA转录和端粒酶抑制的研究

新型抗肿瘤药物的设计是当今化学生物学中发展迅速且具有挑战性的研究领域之一,阴离子卟啉有着比阳离子卟啉更好的膜通透性.利用合成的阴离子卟啉化合物1,2和3,通过凝胶电泳和端粒酶重复序列扩增法(TRAP),研究了药物对DNA转录成为RNA和它们对端粒酶的抑制作用.实验结果表明:阴离子卟啉化合物1,2和3均可抑制DNA的转录和端粒酶的活性,其中化合物2的抑制作用尤为显著,其完全抑制的浓度分别为5 μmol/L和3μmol/L,这与化合物2 β-位所连8个强拉电子的溴原子所导致的整个分子的缺电子性有关.     

基于全基因组De novo测序的异常汉逊酵母菌株792基因组重复序列的分布特征研究

重复序列是基因组的重要组成部分,对生物的进化、遗传和基因的表达调控有重要作用.本研究利用生物信息学方法,在异常汉逊酵母菌株792全基因组de novo测序的基础上,对基因组重复序列的分布特征进行了研究.结果表明,其全基因组中重复序列总长346 417bp,其中,串联重复序列238 164bp,散在重复序列108 253bp,占基因组长度的2.52%,平均每4.05Kb就有一个重复序列.微卫星DNA序列中重复单元拷贝数大多低于15次,其优势碱基类型为三核苷酸重复,重复单元基序为AAC的微卫星序列数目最多;小卫星DNA序列重复单元拷贝数小于微卫星DNA,主要分布1~3次,重复单元大于15bp的小卫星序列数目随着重复单位长度的增加呈下降趋势.散在重复序列中长末端重复序列(LTR)数目最多,滚环(RC)平均长度最长.本研究结果为汉逊酵母菌的分子定向育种和SSR分子标记的开发提供理论基础.