L-精氨酸对人肝细胞中内源凝血因子Ⅷ表达的激活作用

目的探讨L-精氨酸对人肝细胞LO2中内源凝血因子Ⅷ(Coagulation factorⅧ,FⅧ)表达的激活作用。方法将LO2细胞分为试验组和对照组,试验组加入L-精氨酸(终浓度为10 mmol/L)分别培养24、36、48和60 h,对照组用等体积的灭菌水取代L-精氨酸培养。采用RT-PCR法检测LO2细胞中人FⅧ基因mRNA的转录水平并测序鉴定,一期法检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性(FⅧ∶C),Western blot检测24、48 h时相点LO2细胞中人FⅧ蛋白的表达,免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察L-精氨酸作用48 h后LO2细胞中人FⅧ的表达。结果加入L-精氨酸培养36、48、60 h后,LO2细胞中有人FⅧ基因mRNA的转录,而对照组未出现人FⅧ基因mRNA的转录;各时相点两组细胞培养上清液中人FⅧ∶C的水平差异均无统计学意义(P>0.05);Western blot及激光共聚焦均观察到加L-精氨酸培养48 h后LO2细胞中出现人FⅧ的表达,而对照组细胞中均无人FⅧ的表达。结论 L-精氨酸可激活人正常肝细胞中内源FⅧ的表达。     

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。     

表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性分析

目的 分析表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性,确定细胞的生产稳定代次.方法 取表达rhGH-fc融合蛋白的CHO细胞(35代),连续传代建立50、70、90代细胞库.复苏各代次细胞并进行培养表达,绘制不同代次的细胞生...     

重组人红细胞生成素二聚体工程细胞的建立

目的建立重组人红细胞生成素二聚体工程细胞株。方法用重组人红细胞生成素二聚体表达载体转染COS-7细胞,通过dot blot进行检定。然后对CHO-dhfr-细胞进行稳定转染,再经过稀释克隆和MTX的加压扩增,筛选二聚体工程细胞株并进行传代及无血清培养基培养、目的蛋白纯化及检测。结果瞬时转染70h细胞有目的蛋白表达。稳定转染后选取表达量最高的细胞株为工程细胞株。该细胞株连续传15代及经无血清培养基培养,目的蛋白表达量均无明显下降。所表达的目的蛋白相对分子质量为70000,并具有高度特异性。结论已获得稳定高效表达重组人红细胞生成素二聚体的工程细胞株。     

重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定

目的利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株。采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性。结论利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础。     

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。     

MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

目的构建胰岛素启动子肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)基因的真核表达质粒,并观察MafA基因在人肝癌细胞HePG-2中的表达及其作用,为糖尿病基因治疗的研究奠定基础。方法提取小鼠胰腺组织总RNA,经RT-PCR扩增MafA基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N2和pEGFP-C1中。用脂质体将重组表达质粒转染至人肝癌细胞HePG-2中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测转染细胞中MafA和insulinⅡ基因的转录水平,Western blot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。结果重组表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA经PCR、双酶切和测序证明构建正确;重组质粒转染的HePG-2细胞有绿色荧光蛋白表达;经RT-PCR可检测到MafA基因表达,但未检测到insulinⅡ基因表达;经Westernblot检测,在相对分子质量约70 000处可见特异性反应条带。结论已成功构建了MafA基因真核表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,以其转染的HePG-2细胞可表达MafA基因,并翻译成蛋白,但未表达insulinⅡ基因。     

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。     

重组人凝血因子Ⅸ在CHO细胞中的表达和纯化

目的在CHO细胞中表达并纯化人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)。方法将高表达hFⅨ的CHO细胞株在摇瓶中用无血清培养基进行批次培养和补料批次培养,收获补料批次培养上清,通过阴离子交换层析进行纯化,测定纯化产物的蛋白浓度及hFⅨ活性,并进行SDS-PAGE分析。结果批次和补料批次培养表达的hFⅨ活性分别高达0. 62和14. 45 IU/mL。纯化后的h FⅨ比活性高达157. 19 IU/mg。SDS-PAGE分析表明重组CHO工程细胞株能正确表达hFⅨ。结论成功在CHO细胞中表达并纯化了高比活性的重组hFⅨ蛋白,为进一步研制重组FⅨ药物奠定了基础。     

西尼罗病毒E蛋白在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的表达及其鉴定

目的利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)囊膜E蛋白,并进行鉴定。方法利用分子克隆技术将WNV E基因克隆至杆状病毒供体质粒p Fast Bac1中,构建重组供体质粒p Fast Bac-E,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组穿梭质粒Bac-E,转染sf9细胞,收获含WNV E基因的重组杆状病毒Ac MNPV-E,采用间接免疫荧光及Western blot法检测E蛋白的表达。结果重组供体质粒p Fast Bac-E经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,重组穿梭质粒Bac-E经PCR鉴定证明构建正确,转染约96 h后,sf9细胞体积变大、变圆,细胞颗粒化,进而从培养板上脱落,漂浮,收获的第1代Ac MNPV-E经PCR鉴定为阳性。感染重组杆状病毒Ac MNPV-E的sf9细胞周围出现绿色荧光,表达的目的蛋白可与兔抗WNV E蛋白多克隆抗体及鼠抗His单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约53 000处可见目的蛋白条带。结论利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功表达了WNV E蛋白,为WNV快速诊断方法及新型疫苗的建立奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。     

可溶性重组蛋白EGF-Ang构建及体外细胞毒性检测

目的 构建人源化的免疫融合蛋白，以期获得具有较低免疫原性的靶向治疗药物。方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子（EGF）和人血管生成素（Ang)基因连接起来，克隆高效表达载体pET20b( )中，构建重组表达质粒pET20-EA，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白（EGF-Ang)。用MTT法检测可溶性蛋白的细胞毒辣性作用。结果 经SDS-PAGE和薄层扫描分析表明，外源蛋白表达量占菌体裂解蛋白总量的6.4%。细胞活性检测表明EGF-Ang重组蛋白在体外对过度表达EGFR的Hep2和SP2/0细胞具有明显杀伤作用。结论 人源化免疫融合蛋白EGF-Ang的构建为进一步研制具有较低免疫原性的靶向抗癌药物奠定了基础。     

蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响

目的构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E.coli生长的影响。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala),将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数。结果PCR扩增的目的片段长542bp,重组表达质粒测序分析证明目的基因如预期突变;ELISA可检测到目的蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4h,重组菌A600值由0.8下降至0.6;诱导2h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml。结论已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌。     

RGD特异性结合多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因的克隆表达及其抑瘤活性

目的构建RGD多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因,进一步提高rmhTNF的临床疗效。方法应用基因重组技术构建了CRGDC与rmhTNF的融合基因,在E.coliDH5α中诱导表达重组蛋白RGDrmhTNF,采用溶菌酶法裂解菌体,裂解上清经硫酸铵沉淀、阴阳离子交换层析纯化后,用S180荷瘤小鼠模型和L929细胞体外杀伤实验测定纯化的重组蛋白RGDrmhTNF的体内、外杀伤活性。结果正确构建了编码RGDrmhTNF融合基因,重组工程菌升温诱导后以部分可溶形式表达RGDrmhTNF,纯化后纯度为96.88%,体外对L929细胞杀伤作用的比活性为3.6×108IUmg,与rmhTNF相当(3.0×108IUmg)。在S180荷瘤小鼠模型中,当RGDrmhTNF剂量为12×105IUkg时,对肿瘤的生长抑制率为84.9%,显著高于相同剂量的rmhTNF(肿瘤抑制率为59.09%,P<0.01)和环磷酰胺组(肿瘤抑制率为71.21%,P<0.01)。结论重组蛋白RGDrmhTNF可以提高rmhTNF的治疗效果。     

Neurturin基因的克隆及其在Vero细胞中的表达

目的克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero细胞中表达。方法用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析。结果重组质粒pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变。结论获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。