外膜蛋白C作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡表面的可行性

目的 探讨外膜蛋白C(outer membrane protein C,OmpC)作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡（outer membrane vesicle,OMV）表面的可行性。方法 构建含有ompC基因片段及金黄色葡萄球菌EsxA抗原基因（esxA基因）的重组表达质粒,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析。提取重组菌OMV,经12%SDS-PAGE分析OMV总蛋白,并采用Western blot法和纳米流式仪检测融合蛋白定位至OMV表面的情况。结果 含ompC基因和esxA基因的重组表达质粒经测序证明构建正确。融合蛋白OmpC-EsxA经12%SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约57 000的目的蛋白条带,大小与预期相符。OMV总蛋白经12%SDS-PAGE分析,可见多条蛋白条带,表明成功提取重组菌OMV。重组菌OMV表面的融合蛋白OmpC-EsxA可与小鼠抗His-Tag抗体发生特异性结合,且纳米流式仪可检测到荧光抗体标记的OMV。结论 OmpC可作为蛋白呈递平台将抗原定位至OMV表面,有望应用于抗...     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的研究

本文以简化的方法从伤寒沙门氏菌Ty2菌苗株制备外膜蛋白(Outer membraneprotein,简写为OMP),OMP的生化检测显示主要为蛋白质,并有少量LPS污染,不含有Vi多糖。由SDS-PAGE显示OMP为一组分子量介于17～70KD的蛋白质,其中分子量为36～41KD左右的蛋白带为主要蛋白带。OMP有良好的免疫原性和抗原性,不加佐剂免疫动物可产生高效价抗血清,玻片凝集试验能与不同类型抗原结构的伤寒沙门氏菌凝集,但这种凝集可因细菌Vi抗原的存在而被阻抑。动物试验表明OMP有良好的免疫原性,自动和被动免疫力试验均能对小鼠有良好的保护作用,表明OMP是一种保护性抗原。动物热原试验和体重减轻试验及毒性试验均符合有关要求。     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的分离和鉴定

用 Triton X-100处理伤寒沙门氏菌外膜,经3次超离后从上清液中获得外膜蛋白(OMPs)。SDS-PAGE 显示,OMPs 蛋白带的分子量在17～70KD 间,其中分子量为36～41KD的主要蛋白占总 OMPs 的50～60%。经测定2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)的含量间接测得,OMPs 中脂多糖(LPS)的污染量约为4%。用 OMPs 免疫家兔,抗体效价琼脂双扩散法为1:64,ELISA 法为1:12 500。免疫印迹法显示,兔抗-OMP 血清主要与 OMPs 中的主要蛋白发生反应。     

霍乱弧菌外膜蛋白抗原的共同性和特异性

通过免疫吸收试验证明,不同生物型和血清型的霍乱弧菌外膜蛋白(OMP)是共同抗原,它们之间可互相完全吸收,共同抗原是分子量约为47K和86K的IA组分。OMP和IA组分对01霍乱弧菌是特异性抗原,其抗IA血清经LPS吸收只能与霍乱弧菌发生阳性反应,与NAG和其它革兰氏阴性菌的参试株不发生阳性反应。霍乱弧菌LPS是与革兰氏阴性菌发生交叉反应的物质,以LPS为基础制备的多价血清及其分型血清,难免发生非特异的交叉反应。     

鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白(porin)的提纯及鉴定

采用超声破碎、TritonX－100溶解、Sephacryl超细S－300和SephadexG－150凝胶过滤提纯了鼠伤寒杆菌的外膜蛋白porin。经检测其中LPS的含量约为0．06％。经SDS—PAGE图谱分析，porin在36KDa位置处显示一条蛋白带；用免疫印迹将OMPs兔抗血清与porin结合，仅在36KDa位置显示一明显的印迹带。     

钩端螺旋体外膜蛋白致病性及免疫性研究进展

钩端螺旋体外膜蛋白在钩端螺旋体的致病与免疫应答过程中起着十分重要的作用,它在疾病感染时既可以作为一种外膜毒性物质,又可以作为一种特异性抗原而诱导免疫应答。本文作者对钩端螺旋体外膜蛋白的生物学特性、致病机理和免疫原性作了全面的综述,为有效地筛选特异的钩体候选疫苗提供可靠的依据,也为特异地诊断和预防钩体病奠定基础。     

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果 Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256 000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。     

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化。方法从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEAⅠ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEAⅠ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化。结果重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEAⅠ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10 000。纯化的重组HSP65-PEAⅠ蛋白纯度达90%以上。结论已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEAⅠ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础。     

B族链球菌表面免疫原性蛋白的免疫原性及其抗体保护功能

目的制备B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip),研究其免疫原性及抗体保护功能,为GBS蛋白疫苗研究奠定基础。方法采用基因重组技术构建表达载体,并表达GP-Sip融合蛋白。用pET-Sip融合蛋白免疫小鼠,并免疫家兔制备多克隆抗体。Western blot检测GP-Sip蛋白特异性,ELISA检测家兔及小鼠血清中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的功能。结果表达载体经酶切和测序证明构建正确,GP-Sip蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,纯化后纯度可达90%以上。Western blot显示GP-Sip蛋白可与pET-Sip蛋白的免疫血清发生免疫反应。ELISA显示Sip可诱发小鼠产生高水平的IgG抗体。Sip抗血清具有明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论已成功构建GP-Sip表达载体,并高效表达了Sip。该蛋白具有良好的免疫原性,其抗体具有良好保护功能,可作为GBS蛋白疫苗成分或荚膜多糖疫苗载体成分。     

羟基苯甲酸酯对绿脓杆菌防腐作用的研究

通过向以羟基苯甲酸甲酯、丙酯为防腐剂的表面活性剂中接种ATCC标准绿脓杆菌和“wild”绿脓杆菌,对羟基苯甲酸酯中羟基位不同位置的防腐剂防腐效能进行实验研究。结果表明：各种结构的羟基苯甲酸酯对ATCC标准绿脓杆菌均有较佳的防腐作用。但羟基在对位结构的苯甲酸酯能被“wild”绿脓杆菌代谢,而“wild”绿脓杆菌不能代谢羟基在邻位和间位的羟基苯甲酸酯。     

绿脓杆菌无细胞菌苗的研制

作者从绿杆菌粘液中提取抗原制备无细胞菌苗,该菌苗主要由蛋白、多糖和核酸组成,具有低毒性、免疫剂量小(40μg/只小鼠)和产生抗体效价高(>1∶2560PHA 法)等优点。生产工艺简便、稳定,适宜于较大规模生产。     

梅毒螺旋体特异抗原TP0684的克隆和表达

目的克隆并表达梅毒螺旋体外膜蛋白TP0684,为研制早期诊断试剂盒提供依据。方法PCR法扩增TP0684编码基因。T-A克隆后构建表达质粒pET-22b(+)-TP0684,经酶切鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了1212bp的目的片段,原核表达质粒pET-22b(+)-TP0684酶切鉴定正确,测序结果与GenBank上公布的该基因的CDS序列完全一致。转化E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约43000,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TP0684重组蛋白具有良好的免疫反应性,为进一步研究梅毒血清学诊断试剂奠定了基础。     

A Novel Antimicrobial Peptide Sp-LECin with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity and Anti-Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish

New antimicrobial agents are urgently needed to address the increasing emergence and dissemination of multidrug-resistant bacteria. In the study, a chemically synthesized truncated peptide containing 22-amino acids derived from a C-type lectin homolog SpCTL6 of Scylla paramamosain was screened and found to exhibit broad-spectrum antimicrobial activity, indicating that it is an antimicrobial peptide (AMP), named Sp-LECin. Sp-LECin possessed the basic characteristics of most cationic AMPs, such as positive charge (+4) and a relatively high hydrophobicity (45%). After treatment with Sp-LECin, the disruption of microbial membrane integrity and even leakage of cellular contents was observed by scanning electron microscopy (SEM). In addition, Sp-LECin could bind lipopolysaccharide (LPS), increase the outer and inner membrane permeability and induce reactive oxygen species (ROS) production, ultimately leading to the death of Pseudomonas aeruginosa. Furthermore, Sp-LECin exhibited potent anti-biofilm activity against P. aeruginosa during both biofilm formation and maturation. Notably, Sp-LECin had no obvious cytotoxicity and could greatly improve the survival of P. aeruginosa-infected zebrafish, by approximately 40% over the control group after 72 h of treatment. This study indicated that Sp-LECin is a promising antibacterial agent with the potential to be used against devastating global pathogen infections such as P. aeruginosa.     

Photoinactivation of Pseudomonas aeruginosa Biofilm by Dicationic Diaryl-Porphyrin

In recent years, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) has received increasing attention as a promising tool aimed at both treating microbial infections and sanitizing environments. Since biofilm formation on biological and inert surfaces makes difficult the eradication of bacterial communities, further studies are needed to investigate such tricky issue. In this work, a panel of 13 diaryl-porphyrins (neutral, mono- and di-cationic) was taken in consideration to photoinactivate Pseudomonas aeruginosa. Among cationic photosensitizers (PSs) able to efficiently bind cells, in this study two dicationic showed to be intrinsically toxic and were ruled out by further investigations. In particular, the dicationic porphyrin (P11) that was not toxic, showed a better photoinactivation rate than monocationic in suspended cells. Furthermore, it was very efficient in inhibiting the biofilms produced by the model microorganism Pseudomonas aeruginosa PAO1 and by clinical strains derived from urinary tract infection and cystic fibrosis patients. Since P. aeruginosa represents a target very difficult to inactivate, this study confirms the potential of dicationic diaryl-porphyrins as photo-activated antimicrobials in different applicative fields, from clinical to environmental ones.     

铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展

铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是该菌分泌的外毒素之一,通过催化细胞延伸因子2(elongation factor-2,EF-2)的ADP核糖基化,抑制蛋白合成,从而导致细胞死亡,在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病中发挥重要作用。PEA强烈的细胞毒性特点使得该毒素成为免疫毒素的重要成分之一,已广泛应用于肿瘤的靶向治疗中。此外,由于PEA可与抗原提呈细胞表面的α₂巨球蛋白受体结合,通过胞饮作用进入胞内,辅助抗原的处理和提呈,可作为分子佐剂应用于各种疫苗的研发。本文对PEA在免疫毒素及疫苗佐剂方面应用的研究进展作一综述。