基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化

本文研究了裸磁珠对金黄色葡萄球菌吸附效果,优化吸附条件,研究金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的吸附情况,最终将其应用于牛肉样品中金黄色葡萄球菌的检测。通过实验,优化裸磁珠吸附菌体的最小磁珠用量,最小吸附体积和最短吸附时间,并分析是否满足荧光PCR检测需要。结果表明:裸磁珠对浓度为102～107 cfu/mL金黄色葡萄球菌的吸附率在95%以上,有较好吸附效果;10 mg裸磁珠在5 mL菌液中吸附10 min,从磁珠上提取的DNA浓度和纯度可以满足荧光PCR的检测要求;裸磁珠在混合菌体中吸附到的金黄色葡萄球菌可以被荧光PCR检测出来,裸磁珠在牛肉样品中吸附浓度为102 cfu/mL金黄色葡萄球菌提取的DNA可以被荧光PCR检测出来。因此,裸磁珠可用于食品中金黄色葡萄球菌的富集,满足荧光PCR检测菌体量要求。     

燕窝DNA提取方法比较

为建立不同燕窝样品有效DNA提取方法,分别用试剂盒法、改良CTAB裂解法以及改良试剂盒法提取燕窝总DNA,进行浓度纯度检测,并以此为模版,进行PCR扩增及凝胶电泳。结果表明,改良试剂盒法扩增结果条带明亮,信号较强,较改良CTAB裂解液法与试剂盒法,更适于燕窝样品DNA提取,可用于PCR模版DNA制备,为进一步鉴定燕窝真伪提供参考。     

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法的比较分析

DNA的提取效率是影响食品中致病菌PCR检测的关键因素。以速冻面米制品中最易污染的金黄色葡萄球菌为研究对象,比较4种DNA提取方法(CTAB法、离心柱法、氨基化纳米磁珠法、羧基化纳米磁珠法)的效率和质量,对提取的DNA采用荧光定量PCR方法评价。结果表明,在三大类速冻面米制品(肉馅类、素馅类和无馅类)人工污染金黄色葡萄球菌的样品中,羧基化纳米磁珠法和氨基化羧纳米磁珠法的提取效率显著优于CTAB法和离心柱法,可推荐为速冻面米制品中金黄色葡萄球菌污染快速定量检测的DNA提取方法 。     

PCR 检测牛乳中大肠杆菌基因组DNA 的提取方法

为获得一种适于牛乳样品大肠杆菌PCR 检测的基因组DNA 提取方法,对饱和酚法、CTAB 法、试剂盒法及溶剂裂解法等4 种提取方法加以比较,通过考察DNA 的纯度、定量分析以及PCR 分析,确定一套有效、快速、适合牛乳中提取大肠杆菌的基因组DNA 方法--溶剂热裂解法。结果显示该方法提取的DNA 模板,适于PCR扩增大肠杆菌DNA,可以用于牛乳中的大肠杆菌检测。     

实时荧光PCR在食源性致病菌监测中的应用研究

目的 建立沙门菌、志贺菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157:H7、金黄色葡萄球菌5种致病菌的实时荧光PCR检测方法,并在食源性致病菌监测工作中推广应用.方法 将菌株及样品经培养基增菌后,用热裂解法提取DNA,使用荧光定量PCR反应试剂盒,时该检测方法进行特异性验证,并在2006-2007年间,同时应用实时荧光PCR和传统方法对890份各类实际工作监测标本进行比较分析.结果 实时荧光PCR方法对19株不同种类标准菌株符合率为100%;对用传统方法检测分离到的5种食源性致病菌的符合率分别为:沙门菌96.61%,单核细胞增生李斯特菌92.30%,大肠埃希菌O157:H7、志贺菌、金黄色葡萄球菌均为100%;对890份监测标本检测结果表明,实时荧光PCR法对食品及临床标本中食源性致病菌的检出率略高于传统培养法,差异无统计学意义,而实时荧光PCR法可在3～36 h内时目标样品作出结果判断.结论 实时荧光PCR方法成功应用于食源性致病菌的检测,具有快速、特异和灵敏的特点,可作为食物中毒等突发公共卫生事件处置和重大活动食品安全保障工作的有效技术支撑.     

金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的优化

实验分别采用CTAB法、碱法、改良型碱法、改良型SDS法等提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,比较其提取质量,对金黄色葡萄球菌总DNA提取方法进行优化,以便高效、节约的应用于聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学研究。结果表明:改良型SDS法稳定性好,能够有效破壁,DNA的质量高,A260/A280为1.76,介于1.75~1.85之间。提取所需时间较少,仅需40 min,有利于金黄色葡萄球菌总DNA高效、快捷的提取。     

莴苣中两种致泻性大肠杆菌的富集及DNA提取方法的优化

本研究对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的莴苣样品中菌体的富集和DNA提取方法进行了优化。研究中比较了不同过滤膜组合对菌体的富集效果,筛选了莴苣样品中细菌DNA提取的最适方法,建立了多重PCR方法检测人工污染莴苣样品。结果表明,采用尼龙膜15μm+混合膜0.22μm的组合富集细菌、试剂盒法提取样品中细菌DNA,多重PCR检测的检出限降低10倍,检测时间节省1.5 h。本研究可快速、简便、灵敏的应用于莴苣检测中,具有很高的实际应用价值。     

粮食真菌DNA快速高通量提取方法的建立与应用

目的 建立一种高效、快速、高通量的粮食中真菌DNA提取和分析方法,并应用于小麦产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)镰刀菌污染状况研究。方法 基于磁珠纯化技术,开发了一种粮食基质中真菌DNA的快速提取方法—月桂酰肌氨酸钠(sodium lauroyl sarcosine, SLS)磁珠法,结合前期采用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qPCR)和微滴式数字PCR法(droplet digital PCR, ddPCR)建立的小麦中3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol, 3-ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol, 15-ADON)两种产DON毒素化学型镰刀菌及禾谷镰刀菌复合群分析方法,对其提取效果进行了验证并分析了我国2021年新收获小麦产DON镰刀菌的污染水平。结果 与十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法试剂盒和磁珠法试剂盒相比较,本研究建立的SLS磁珠法裂解过程无需水浴,配合自动化提取设备工作,整个提取时间小于1 h,对禾谷镰刀菌复合群的提取率最优,而对3-ADON和15-ADON化学型镰刀菌的提取率与经典CTAB法、磁珠法试剂盒没有显著性差异,并且显著性优于柱式法试剂盒。在对2021年收获的120个小麦样品监测结果显示,产DON镰刀菌的生物量与DON毒素水平之间具有极显著的相关性(P<0.01)。结论 SLS磁珠法适用于从基质复杂的粮食样品中提取真菌DNA,操作简便快速、提取率高,更易实现大样本量的分子生物学准确定量检测需求。     

几种食用植物油DNA提取方法效果比较

本文主要研究高效简便的食用植物油DNA提取方法,为食用植物油后续核酸检测实验奠定基础。本次实验选取11份不同原料市售食用植物油为实验样品,进行核酸富集处理,采用CTAB法和三种不同试剂盒法对富集前后样品进行DNA提取,用植物叶绿体t RNA基因扩增结果评估DNA提取效率。最后得出,结合核酸富集与CTAB法、DNeasy?Plant试剂盒提取食用油DNA,可应用于后续植物油基因检测和成分鉴定。     

食用植物油DNA提取方法的优化

目的建立可从不同种类食用植物油中提取得到高质量的、可用于分子生物学检测的DNA的提取方法。方法使用2种改进十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)和2种商用试剂盒提取6种食用植物油的DNA,通过紫外分光光度计检测所得DNA样品的浓度和纯度。设计特异性引物,并通过普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测DNA样品是否可用于分子生物学分析。结果使用改良CTAB法1及2种商业试剂盒无法有效提取得到的6种食用植物油的DNA,样品无法满足分子生物学检测的需要,使用改良CTAB法2提取得到的6种食用植物油DNA纯度和浓度检测结果均为最佳,其提取的橄榄油、菜籽油、花生油DNA样品可用于后续实时荧光定量PCR检测。结论该方法可为橄榄油、菜籽油、花生油DNA提取提供有效手段,为食用植物油检测和研究奠定基础。     

DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

一种适用于乳制品基因组DNA快速提取方法的研究

目的对比NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种方法提取乳制品中核酸的提取效果,优化提取条件,确定一种更适用于现场检测、简便快速的的乳制品DNA快速提取技术。方法以牛奶、水牛奶、牦牛奶、羊奶、骆驼奶、以及驴奶6种常见的乳制品为材料,分别用NaOH裂解法、PBS裂解法以及直接煮沸法3种提取方法提取乳制品中的DNA,并根据裂解液用量和裂解时间进行优化,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,检测DNA提取的质量和灵敏度。结果 NaOH裂解法能够提取所有物种的乳制品DNA,而且可以在最佳裂解条件下提取模拟掺假混合乳的DNA进行检测,发现其检测限能达到1%的牛奶含量。结论该方法取样量小,成本低,在15 min内即可完成快速提取,为实验室乳制品DNA定性或定量鉴别,以及乳制品的现场掺假鉴别提供了一种快速灵敏低成本的样品前处理技术。     

羊绒羊毛纤维线粒体DNA提取方法研究

研究和开发动物纤维的DNA检测,关键的技术难点在于DNA的提取。文章就羊绒羊毛纤维线粒体DNA的提取方法进行了实验,并通过PCR扩增的方法进行了验证。结果表明:使用Promega试剂盒,将纤维样品尽量处理成粉末状,并在样品经裂解液处理后先离心除去其中尚未完全溶解的纤维,然后进行后续操作是比较有利的,完全能够得到满足PCR扩增和DNA测序要求的线粒体DNA样品。     

用于PCR检测的乳品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法比较研究

比较了乳品中金黄色葡萄球菌DNA的6种提取方法的效果,确定了一种可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA的方法。该方法无需对样品进行增菌,可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA,作为模板进行PCR检测,检测效果良好,对UHT全脂乳、脱脂乳和奶酪的最低检出限分别为10、10CFU/mL和55CFU/g。     

金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒用国家参考品的研制

目的 研制金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒用国家参考品。方法 将10株金黄色葡萄球菌和10株阴性对照代表性菌株分别在适宜条件下复苏培养, 制备合适浓度的菌悬液,并加热灭活和分装。随机抽样不同候选参考品样品10支进行均匀性分析,并将样品分别置于2~8℃、25℃、37℃条件下保藏以及反复冻融, 对标准物质的稳定性进行评价。同时对候选参考品的准确性、特异性、重复性、最低检出限分析, 并组织8家实验室进行协作标定。结果 制备了由阳性、阴性、重复性和最低检出限样品组成的金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒用候选参考品。结果显示不同候选参考品样品的均匀性与稳定性良好, 特异、重复性好;除P6阳性候选参考品样品不能被部分试剂盒检出,其余阳性参考品样品均能成功检测、最低检出限为1.0×103个/mL。协作标定结果也进一步表明阳性、阴性、重复性和最低检出限候选参考品均符合国家参考品的各项要求。结论 研制的金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒用国家参考品已获得批准, 可用于金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒的质量控制和评价。     

3种分子生物学方法检测金黄色葡萄球菌的 比较研究

目的比较常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)对金黄色葡萄球菌的检测效果。方法以金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)标准菌株(ATCC6538)DNA为模板,以耐热核酸酶(Nuc)基因为靶标,采用常规PCR、qPCR和LAMP对其进行扩增并比较其检测灵敏度,同时对鸡蛋中金黄色葡萄球菌的检出率进行比较。结果常规PCR对S.aureus的检测灵敏度为400个基因拷贝数,低于实时荧光定量PCR和LAMP的40个基因拷贝数的检出限。在实际样品检测中常规PCR对50份鸡蛋外壳样品中S.aureus的检出率为6%,qPCR和LAMP的检出率分别为10%,而在鸡蛋内容物中均未检测到。结论 3种检测方法检测S.aureus均具有较高的灵敏度,但常规PCR的灵敏度低于qPCR和LAMP检测方法,qPCR需要昂贵的仪器,不适合基层现场应用,而LAMP方法简单、快捷,具有良好的应用前景。     

应用基因芯片技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌的研究

目的:建立快速鉴定食源性金黄色葡萄球菌的基因芯片技术。方法:采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌16SrRNA基因的DNA片段,序列进行BLAST比较并通过软件设计其特异性探针,采用基因芯片杂交技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌样品。结果:对所有样品进行基因芯片杂交技术处理并扫描观察,金黄色葡萄球菌的杂交结果呈阳性,其检测结果与传统方法鉴定结果一致。结论:应用基因芯片鉴定技术可快速、准确地鉴定食源性金黄色葡萄球菌,值得推广应用。     

山羊绒DNA的提取及验证

提取DNA是利用PCR技术检测纤维的关键技术难点。本文对山羊绒DNA的提取方法进行了试验,并通过PCR扩增的方法进行验证。结果表明:使用Ta Ka Ra Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒,将纤维样品尽量处理成粉末状,并在样品经裂解液处理后先离心除去其中尚未完全溶解的纤维,然后进行PCR扩增是比较有利的,完全能够得到满足PCR扩增要求的DNA样品。     

基因芯片技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌

为了建立快速鉴定食派陛金黄色葡萄球菌的基因芯片技术，采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌16SrRNA基因的DNA片段．序列进行BLAST比较并通过软件设计其特异性探针，采用基因芯片杂交技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌样品。结果：对所有样品进行基因芯片杂交技术处理并扫描观察，金黄色葡萄球菌的杂交结果呈阳性，其检测结果与传统方法鉴定结果一致。结论：应用基因芯片鉴定技术可快速、准确地鉴定食源性金黄色葡萄球菌，值得推广应用。