重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组人抗缪勒管激素(human anti-Müllerian hormone,hAMH)C-末端蛋白,并进行纯化。方法 PCR法扩增hAMH C-末端蛋白基因,插入至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-hAMH C。重组质粒转化感受态E. coli BL21(DE3),终浓度为1. 0 mmol/L的IPTG诱导表达h AMH C-末端蛋白。扩大培养后进行Ni亲和层析柱纯化,12%SDS-PAGE分析纯化产物。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pET-28a-hAMH C构建正确。表达及纯化产物均可见相对分子质量约12 500的目的蛋白条带,纯度达90%以上。结论原核表达了重组hAMH C-末端蛋白,纯化后获得了较高纯度的目的蛋白。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

新孢子虫表面抗原P40基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达新孢子虫表面抗原P40基因。方法 PCR扩增新孢子虫表面抗原P40基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-P40,转化入大肠埃希菌Rosseta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒pET-28a-P40经PCR及双酶切鉴定构建正确;表达的重组P40蛋白相对分子质量约为40 000,有效识别鼠抗新孢子虫阳性血清。结论成功在Rosseta(DE3)中表达了新孢子虫表面抗原P40基因,为新孢子虫病疫苗的研制及血清学检测方法的建立奠定了基础。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS,为深入研究其功能及其在幽门螺杆菌耐酸机制中的作用奠定基础。方法以幽门螺杆菌菌株26695基因组为模板,采用PCR法扩增ArsS基因,插入pET-22b(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS,转化E.coliBL21(DE3),0.5mmol/LIPTG25℃诱导表达,并采用亲和层析与分子筛层析对重组蛋白进行纯化。结果重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组蛋白以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;分子筛层析图谱显示,在150mmol/LNaCl条件下,目的蛋白层析效果较好,纯化后的重组蛋白纯度可达95%以上,浓度约为10mg/ml。结论已成功原核表达并纯化获得了高纯度的ArsS蛋白。     

牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2蛋白。方法采用PCR法从牛Ⅱ型链球菌基因组DNA中扩增van B2基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-van B2,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果 PCR扩增获得597 bp的van B2基因片段;重组表达质粒pET-28a-van B2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组van B2蛋白相对分子质量约为29 000,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度为70%,可被小鼠抗牛链球菌血清Ⅱ型多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白,为van B2基因的耐药性研究奠定了物质基础。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白的原核表达及其抗菌活性

目的原核表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)和抗菌肽tachyplesins融合蛋白,并检测其抗菌活性。方法人工合成抗菌肽tachyplesins基因和linker,与pMD18-T-hLYZ上切下的hLYZ基因融合,将融合基因克隆至带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后,进行抗菌活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-hLYZ-tachyplesins经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约44000处可见目的蛋白条带,诱导温度在25℃,IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为6h,融合蛋白表达效果较好,主要以可溶性形式存在;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用。结论已成功在原核细胞中表达了人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白,纯化的融合蛋白具有一定的抗菌活性。     

NIRF蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。     

翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entertoxin B,SEB)。方法以合成的SEB全基因序列为模板,PCR扩增SEB基因片段,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-SEB,转化E.coil BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经硫酸铵盐析、SP阳离子层析柱、Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱纯化后,用Thrombin切除组氨酸标签,再经Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱和DEAE阴离子层析柱纯化。结果重组原核表达质粒pET-28a-SEB经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为31 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%。最终纯化后的重组SEB蛋白纯度可达90%以上。结论成功构建了SEB基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了重组SEB蛋白,为进一步研究其致病机理及防控方法奠定了基础。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。