HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。     

中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的获得高质量的中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白抗原。方法改造表达载体,以构建中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白基因带有筛选标记的真核细胞表达质粒,将所构建质粒转染真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出能够高效、持续表达包膜蛋白的稳定表达细胞株。结果所构建的表达载体pVRPEnv转染细胞后可表达目的蛋白,并建立了稳定表达细胞系。结论获得了可以高效、持续稳定表达中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白的细胞株。     

水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体。结论该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。     

利用细菌／杆状病毒系统昆虫细胞中表达HIV—1Gag蛋白

目的 在昆虫细胞中表达中国流行株B亚型HIV－1Gag蛋白，制备重组Gag蛋白。方法 将中国株B亚型HIV－1的Gag全基因序列，克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中，构建了重组质粒pfastGag。经转座及平板筛选，提取重组穿梭质粒Bacmid。经转染Sf9昆虫细胞后，获得了重组杆状病毒。用SDS－PAGE、Westem blot和间接免疫荧光实验分析的目的的蛋白。结果 重组病毒在昆虫细胞Sf9中高效表达了中国株B株型HIV－1Gag蛋白，表达的重组蛋白具有良好的抗原活性，可与HIV－1标准阳性血清及p24单克隆抗体发生较强的免疫反应。结论 重组表达产物可用于艾滋病的免疫诊断和疫苗研究。     

H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒,并观察其免疫原性。方法分析H5N1人禽流感病毒HA基因的进化关系,人工合成人禽流感病毒HA基因(包含多数H5N1人禽流感病毒共有序列),构建含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和HA融合基因的真核表达质粒pVAX-CLHA及HA基因的真核表达质粒pVAX-HA,经酶切及测序鉴定正确后,转染293-T细胞,经RT-PCR法检测转染细胞中HA基因mRNA的转录水平,间接免疫荧光法(IFA)检测其表达;分别以质粒pVAX-CLHA及pVAX-HA免疫BALB/c小鼠,测定血清HI抗体效价。结果重组DNA疫苗表达质粒pVAX-CLHA和pVAX-HA经酶切及测序证明构建正确,转染的293-T细胞可检测到目的基因的转录及蛋白的表达;3次免疫后均能诱导BALB/c小鼠产生HI抗体,pVAX-CLHA诱导的HI抗体高于pVAX-HA。结论已成功构建了含H5N1HA及CTLA4融合基因的DNA疫苗表达质粒,其对小鼠具有良好的免疫效果,为H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗的开发奠定了基础。     

利用慢病毒包装小窝蛋白-1过表达稳定细胞株的构建

目的 利用慢病毒包装构建过表达小窝蛋白-1(Caveolin-1)的稳定细胞株.方法 PCR扩增仓鼠肾细胞BHK-21中Caveolin-1基因,克隆至pTRIP-CMV载体中,构建重组表达质粒pTRIP-Cav1,将其与对照质粒pTRIP-EGFP分别经Lipofectamine? 2000介导转染HEK-293T细...     

猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。     

编码SARS-CoV S1和S2蛋白的DNA疫苗对小鼠的免疫应答

目的构建编码SARS-CoVS蛋白亚单位S1和S2的核酸疫苗,并检测其对小鼠的免疫应答。方法依据GenBank中SARS-CoV基因组序列,人工合成SARS-CoVS1和S2亚单位基因,分别与CTL表位基因重组后,克隆至表达载体pIRES1neo中,构建DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2。将构建的DNA疫苗转染BHK-21细胞,采用间接免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数,用ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清中抗SARS-CoV抗体水平。结果所构建的DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2转染BHK-21细胞后,均能表达抗原蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,并诱导产生抗SARS-CoV特异性抗体。结论所构建的两种DNA疫苗在小鼠体内均产生了体液和细胞免疫应答,为SARS核酸疫苗的研制奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。     

治疗性HIV-1重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的　构建编码HIV- 1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因嵌合的核酸疫苗 ,并评价其免疫效果。方法　将编码HIV -1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因插入到真核表达载体pVAXI中 ,构建HIV- 1治疗性重组核酸疫苗质粒。通过ELISA试剂盒检测免疫恒河猴血清中HIV -1特异性抗体 ,并通过淋巴细胞转化实验检测HIV -1特异性T淋巴细胞增殖反应。结果　构建的重组核酸疫苗质粒pVAXI -MEGp2 4免疫恒河猴后 ,能有效地刺激产生T淋巴细胞特异性增殖反应 ,并诱导产生抗HIV -1特异性抗体。结论　所构建的重组核酸疫苗质粒能诱导机体产生免疫反应。