乳酸乳球菌镉抗性质粒的鉴定及镉抗性功能片段的获取

为获得乳酸菌食品级筛选标记基因,通过质粒消除、PCR方法和电转化方法鉴定一个镉抗性质粒pCD077。酶切分析结果显示该质粒是一个50kb以上的大质粒。结合PCR及热不对称嵌套PCR的方法获得镉抗性功能片段,为以镉抗性为筛选标记构建乳酸菌食品级载体奠定了基础。     

乳酸乳球菌质粒pAG712的特性研究

乳酸乳球菌质粒pAG712 （15.5kb）赋予乳酸乳球菌细胞凝聚表型,它是以θ模式进行复制,复制蛋白与其它以θ模式进行复制的质粒的复制蛋白具有极高的同源性.复制区上的Bg/Ⅱ （4.2kb）片段决定质粒可以在乳酸乳球菌中进行复制.在本研究中,将抗生素抗性基因插入到质粒pAG712中,给予它选择性的标记,在研究中发现凝聚基因（aggregation gene）的存在导致了乳酸乳球菌质粒pAG712的分离不稳定性。     

镉胁迫下泡菜乳酸乳球菌的形态变化

通过扫描电镜和透射电镜分别观察不同质量浓度水平的Cd2+对泡菜乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）细胞的影响,扫描电镜结果显示：Cd2+质量浓度在0、10 mg/L时,泡菜乳酸乳球菌呈椭圆形、表面光滑、菌体生长繁殖旺盛,随着Cd2+质量浓度的增加菌体细胞表面产生白色颗粒状物质、菌体细胞存活数量大幅下降（OD600 nm值由1.336下降到0.515）。当添加200 mg/L Cd2+时,几乎没有见到明显的菌体、显示有少量棱形晶状物。透射电镜结果显示：当Cd2+质量浓度为0～50 mg/L时泡菜乳酸乳球菌结构完整、细胞内容物分布均、菌体生长较为正常,当菌体暴露于100、200 mg/L Cd2+时菌体细胞出现异常现象,如细胞破裂、内容物从薄膜穿孔中释放、质壁分离等。两类电镜结果均表明：在低质量浓度Cd2+（≤50 mg/L）胁迫下,对泡菜乳酸乳球菌的生长几乎不产生影响,添加Cd2+质量浓度上升到100、200 mg/L时泡菜乳酸乳球菌正常生长受到抑制。     

乳酸乳球菌乳酸亚种产丁二酮的优化研究

分别研究了10种不同因素对乳酸乳球菌乳酸亚种产生丁二酮含量的影响。实验结果表明,各因素产生丁二酮最高量的条件分别为:培养温度为37℃,凝乳后0h,后熟12h,培养基pH调节为5.6,培养基中添加柠檬酸的量为0.15%;培养基中添加Vc的量为0.01%,培养基中添加金属离子的量分别为Mg2+0.03%、Cu2+0.02%、Mn2+0%,培养基中添加甘氨酸的量为0.2%,培养基中添加碳水化合物的量分别为葡萄糖为0%、蔗糖为0%;随着基质浓度增加丁二酮产量也随之增加。     

耐镉肠杆菌的分子鉴定和抗性分析

分离到一株耐镉肠杆菌NP23,对其进行了分子鉴定和抗性研究,分析菌株在不同镉浓度条件下菌体的生长状况以及对Fe2+,Cn2+,Mn2+,Zn2+等重金属抗性,利用SDS法进行质粒消除分析.结果显示,菌株NP23是Enterobacter sp,高浓度的镉使该菌株生长延滞期变长,进入对数期后的生长量相对较低,采用SDS法进行质粒消除,初步确定NP23的镉抗性基因在基因组上,NP23对所分析的四种重金属都有一定抗性,其中对Zn2+和Mn2+的抗性较强,在3200mg/L以上.     

乳球菌的功能性质粒

介绍了乳酸乳球菌中存在的各种对乳品工业化性状有利的主要功能性质粒的生物学特性及其在在改善发酵剂品质及作为基因工程载体方面的应用,这些质粒包括：乳糖利用质粒、柠檬酸利用质粒、胞外多糖合成质粒、蛋白水解质粒、细菌素产生及噬菌体抗性质粒.     

发酵乳球菌菌株的PCR鉴定

对9株发酵乳球菌标准菌株进行MRS固体平板培养基划线分离和镜检观察,采用特异性PCR对其进行鉴定,划线分离得到11株菌;依据各菌种代谢酶编码基因序列差异设计菌种特异性PCR引物,进行PCR扩增,将其在菌株水平上鉴定为9株菌(6株乳酸乳球菌、2株嗜热链球菌和1株无乳链球菌)。实验还获得了2个乳酸乳球菌的种特异性PCR引物LclamyLF-R和LclmapA2F-R、2个嗜热链球菌的种特异性PCR引物SttglgPF-R和SttamyLF-R以及可能是标准菌株AS1.1936的株特异性的PCR引物LclamyYF-R。     

发酵乳球菌菌株的分离鉴定

对9株发酵乳球菌菌株进行MRS固体平板培养基划线分离和形态学比较观察，井采用生化试验和RAPD对其进行鉴定。划线分离得到11株菌：通过菌体常规磷钨酸负染色标本的透射电镜观察，描述了各菌体的大小、形状以及裂殖方式；依据各菌种生化代谢差异设计生化试验．得到了2个发酵型，将其鉴定为2个菌群（乳酸乳球菌乳酸亚种和嗜热链球菌）；20个随机引物的RAPD筛选得到了9个不同的基因型．将其鉴定为9株细菌。     

耐镉肠杆菌的分子鉴定和抗性分析

分离到一株耐镉肠杆菌NP23,对其进行了分子鉴定和抗性研究,分析菌株在不同镉浓度条件下菌体的生长状况以及对Fe²⁺,Cu²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺等重金属抗性,利用SDS法进行质粒消除分析。结果显示,菌株NP23是Enterobacter sp,高浓度的镉使该菌株生长延滞期变长,进入对数期后的生长量相对较低,采用SDS法进行质粒消除,初步确定NP23的镉抗性基因在基因组上,NP23对所分析的四种重金属都有一定抗性,其中对Zn²⁺和Mn²⁺的抗性较强,在3200mg/L以上。      

构建食品级表达纳豆激酶的乳酸乳球菌重组菌株

构建整合型表达载体pFY008,以HisH基因作为同源重组的靶位点,通过同源重组将含有纳豆激酶原基因的表达盒PnisA-aprN整合到乳酸菌的基因组上,实现纳豆激酶在乳酸乳球菌中食品级的表达。构建的食品级基因工程菌安全性高、稳定性好,并赋予了其溶栓的功能。     

乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.Lactis产丁二酮发酵条件研究

对乳酸乳球菌乳亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis发酵丁二酮条件进行研究,通过正交试验优化确定其最佳产丁二酮发酵条件为:温度37℃,起始pH6.5,接种量5%,柠檬酸钠的添加浓度0.75%。在此条件下,菌株在脱脂乳培养基中丁二酮的产量可达到69.58 mg/L。     

乳酸乳球菌中双乙酰代谢支路的调控

描述了从柠檬酸代谢、糖酵解来形成双乙酰的途径及其调节思路，并提出乳酸酸乳球菌的混合酸发酵及其调控机理，对双乙酰代谢支路的的遗传修饰方法进行了综述。结果表明，在特定条件下，有些乳酸菌从同型乳酸发酵转道成为异型乳酸发酵而产生其他代谢物(如甲酸或CO2，乙酸和乙醇)，这种变化涉及到丙酮酸代谢的遗传修饰：降低乳酸脱氢酶(LDH)活力或α-乙酰乳酸脱羧酶(ALD)活力、增加丙酮酸甲酸盐裂解酶(PFL)(厌氧条件)或α-乙酰合成酶(ALS)或丙酮酸脱氢酶(PDH)活力(好氧条件)，这些方法会有效地将糖转化成为双乙酰。对双乙酰代谢支路的调控主要集中在：超产αls或ileBN，失活ldh，pft，aldB或与超产NADH-氧化酶方法相结合使用。     

转lux基因发光乳球菌发光特性研究

为了将转lux基因乳球菌的发光特性应用于检测领域,系统研究了lux基因、世代、培养基、红霉素和培养时间等因素对lux基因发光乳球菌发光强度的影响。与转luxCDABE基因乳球菌相比,转luxAB乳球菌在未添加红霉素的GM17和M17培养基中培养时具有稳定的遗传发光特性。与M17培养基相比,GM17培养基培养的转lux基因发光乳球菌的发光特性更稳定。培养时间对转lux基因发光乳球菌的RLU(Relative light units)值有显著影响(p0.01),一般在培养5 h时发光强度最高,而后持续下降;9 h后发光强度已难以检测。转lux基因发光乳球菌的传代对RLU无显著影响(P0.05)。     

乳酸乳球菌发酵液中乳链菌肽的分离纯化

对乳酸乳球菌乳酸亚种SQ80随pH的改变吸附乳链菌肽的规律进行了研究，pH6．5时吸附率达91．5％，pH3以下吸附率为0。通过调整pH，使乳酸乳球菌选择性地吸附、释放乳链菌肽，达到了较好的分离纯化效果，HPLC检测显示单一尖峰，乳链菌肽回收率58．2％，纯化倍数75。     

转lux基因发光乳球菌产酸特性研究

目的:为使转lux基因发光乳球菌应用于检测领域,研究lux基因、世代、红霉素和培养时间等因素对转lux基因发光乳球菌产酸特性的影响.方法:将筛选的转luxCDA BE基因发光乳球菌、转luxAB基因发光乳球菌菌株活化后接入液体培养基中,30℃培养,测定其产酸能力.结果:基因、世代对转lux基因发光乳球菌的产酸能力无显著影响(P＞0.05),表明转入的lux基因大小对lux基因发光乳球菌的产酸性能无影响.红霉素可明显降低转lux基因发光乳球菌产酸速率,但对其最大产酸能力无显著影响.结论:筛选的转lux基因发光乳球菌的产酸性能具有稳定的遗传特性.     

渗透乳酸克鲁维酵母细胞方法与工艺的研究

研究了渗透乳酸克鲁维酵母细胞生产透性化细胞乳糖酶的方法,并确定了得到最大酶活的工艺条件。     

固定化乳酸乳球菌DL-203发酵生产Nisin的研究

对用固定化乳酸乳球菌DL-203发酵生产Nisin进行了研究。确定采用k-卡拉胶作为固定化载体,并添加磷酸三钙,包埋固定化乳酸乳球菌DL-203发酵生产Nisin。固定化最适条件为3.5%（W/V）k-卡拉胶+0.1%（W/V）磷酸三钙,细胞浓度5%～10%（V/V）。发酵培养基添加0.2%（V/V）吐温-20,30℃摇床培养进行分批重复发酵,可连续使用五批以上,而发酵液Nisin效价未有下降,达游离细胞发酵液的50%～60%。采用柱式填充床反应器进行固定化乳酸乳球菌DL-203连续发酵生产Nisin,停留时间以4～6h比较适宜,可连续稳定生产150h以上,而且固定化小球未有明显的细胞外漏,发酵液Nisin效价可达游离细胞发酵液的30%～40%。      

食源性单核细胞增生李斯特菌的重金属镉抗性及其与抗生素耐药性的关系研究

研究了不同血清型食源性单核细胞增生李斯特菌对重金属镉的抗性及其与抗生素耐药性之间的关系。采用琼脂稀释法检测单核细胞增生李斯特菌对重金属镉的抗性,与菌株的抗生素耐药性进行比较分析。结果表明,73株实验菌株中,36株具有镉抗性,总体镉抗性率达49.3%(36/73)。分离到的5株多重耐药单核细胞增生李斯特菌均为镉抗性菌株,表明食品生产、加工及其储存环境中这种同时携带多重耐药性与重金属抗性的微生物从食品链及有关环境进入到人类,就会对人类健康构成构成潜在威胁。     

产蛋白酶菌株的鉴定及酶学特性

通过形态学观察、生理生化实验以及16S rDNA基因序列分析对分离自味精糖化废渣中的产蛋白酶菌株NX-PB17进行鉴定,并对其蛋白酶特性进行研究。结果表明：菌株NX-PB17为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其蛋白酶最适酶解温度为50℃,最适pH值为7.0,并且具有良好的热稳定性和pH值稳定性。