克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的 通过参加“奶粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力验证计划”,验证实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力,提高实验室检测技能。方法 依据GB 4789.40-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。 结果 编号G785和编号V995的两个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 结论 本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。在本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

乳粉中克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌能力验证样品制备及应用

目的 制备均匀性及稳定性均满足要求的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,用于组织能力验证考核。方法 通过生化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定背景菌株及所使用的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)菌株。采用冷冻干燥技术制备均匀性及稳定性均满足要求且各种菌含量为10⁴ CFU/瓶的能力验证菌球。依据CNAS-GL003∶2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,再将样品存放于-20 ℃、4 ℃进行保藏稳定性检验,存放于25 ℃、37 ℃进行运输稳定性检验。依据GB 4789.40—2016制定作业指导书并发放样品,回收各实验室结果进行统计。结果 目的菌株及背景菌株的鉴定结果均正确,均匀性、运输稳定性及保藏稳定性检验均符合能力验证样品的要求。依据评价原则及25家实验室反馈的结果,2021年度考核结果满意率为100%。结论 乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品满足本年度能力验证的要求,为参加考核的检测机构提供了外部质控考核结果。     

IgG-Biotin-Avidin-HRP信号转导探针结合免疫比色法快速检测克罗诺阪崎肠杆菌

本文建立了一种快速检测克罗诺阪崎肠杆菌的新型免疫比色法。用抗体修饰的磁球(MNPs-IgG)作为捕获探针分离、富集克罗诺阪崎肠杆菌,再通过免疫夹心法分别结合生物素标记的克罗诺阪崎肠杆菌抗体(Biotin-IgG)和亲和素标记的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP),形成的复合物与底物四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)发生显色反应,经硫酸终止后,有色产物的吸光度值与克罗诺阪崎肠杆菌浓度的对数有良好的线性关系,在103～107CFU/mL范围内,线性方程为y=0.2353x-0.2307。本研究成功设计优化了基于比色法的克罗诺阪崎肠杆菌定量检测新方法,检测限为8.68×10~2CFU/mL(S/N=3),加标样品检出率96%,检测时间不超过2.5 h,为实际应用与商品化提供了理论支撑。     

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

LAMP法在阪崎肠杆菌快速检测中的应用

针对阪崎肠杆菌的ompA基因设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立一种快速检测阪崎肠杆菌的DNA环介导恒温扩增法(LAMP)。通过对2株阪崎肠杆菌标准菌株、24株阪崎肠杆菌分离株和18株非阪崎肠杆菌测试,结果表明此方法具有很高的特异性;对其灵敏度进行检验,发现该方法的最低检测限可以达到8CFU/mL,具有较好的敏感性。在1份实验室能力验证盲样和26份实际奶粉样品中应用发现,该方法与传统生化方法结果吻合,具有较好的可靠性。     

环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的研究

目的研究阪崎克罗诺肠杆菌生物膜的形成特性。方法采用结晶紫染色法检测生物膜形成量,考察培养时间、培养温度以及初始pH值3个环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的影响。结果结果表明培养时间、培养温度以及初始pH值对生物膜形成影响较大,且各阪崎克罗诺肠杆菌的最佳成膜条件分别为:阪崎克罗诺肠杆菌CICC21550最适温度为30℃,最适PH为7,最佳培养时间为36h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21562最适温度为30℃,最适pH为5,最佳培养时间为48 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21544最适温度为42℃,最适pH为7,最佳培养时间为24 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21563最适温度为30℃,最适pH为7,最佳培养时间为36 h。结论 4株阪崎克罗诺肠杆菌的生物被膜成膜能力由强及弱依次为阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21550、21544、21563、21562。本研究为阪崎克罗诺肠杆菌生物膜相关研究提供理论参考。     

实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp A基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp A基因。     

2018—2020年度乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品的研制及其应用

目的 制备乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,并应用于2018—2020年度实验室能力验证考核。方法 将背景菌株和克罗诺杆菌属通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备的阴性样品(含背景菌)和阳性样品(含背景菌和克罗诺杆菌属)。随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,然后将样品分别存放于-20℃和4℃进行储藏稳定性检验,存放于25℃和37℃进行运输稳定性检验。向参加考核的实验室发放样品并提供作业指导书,回收各实验室结果进行统计。结果 菌株种属鉴定结果与预期结果一致,均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均满足要求。2018—2020年度考核结果满意率分别为97.1%、94.7%和100%。结论 制备的样品满足此能力验证项目的需求,通过组织能力验证考核可以反映出我国实验室之间差异,有助于进一步提高实验室检验水平。     

冰激凌中阪崎肠杆菌的检测

目的 对市售冰激凌中的阪崎肠杆菌进行抽样检测。方法 按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 (GB 4789.40- 2010)》进行检验。结果 从冰激凌中检出阪崎肠杆菌,经过染色和生化试验, 在29份样品中有3份样品分离出阪崎肠杆菌,检出率为10.34%。结论 市售冰激凌样品中存在一定比例的阪崎肠杆菌,有较大的安全隐患。质检系统应加强对市售的冰激凌的卫生预防与控制。     

6种食源性致病菌质控考核结果分析

目的对承担食品安全风险监测任务的全国各级疾病预防控制中心开展微生物质量控制考核,以评价其对6种食源性致病菌的检验能力。方法 6种质控考核菌株包括单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希菌、沙门菌以及金黄色葡萄球菌。按照2011和2012年设计的组合,将新鲜培养的致病菌增菌液混合后滴加于灭菌奶粉载体中制成样品。2011年考核制备了6种样品(I~VI),2012年为10种样品(A~J)。运用点分数法对两年结果分别进行满意率评价,率的比较用Pearsonx~2检验或对数似然比x~2检验。结果 2011和2012年考核总体满意率分别为86.5%(268/310)和84.3%(375/445),2011年样品满意率最低的是空白样品VI(68.0%,17/25),2012年满意率最低的是G样品(0.0%,0/8)。2011和2012年考核结果主要漏检的是大肠埃希菌,其中2012年大肠埃希菌漏检率占漏检总数的85.7%(60/70)。2011年非考核菌中漏检最多的是金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。2012年考核结果主要多检的是金黄色葡萄球菌,占多检总数的36.8%(7/19)。两年的结果均显示大肠埃希菌和阪崎肠杆菌组合样品中,大肠埃希菌的漏检率明显增高。沙门菌和大肠埃希菌的血清分型正确率较低,分别为41.5%(95/229)和45.1%(105/233)。单核细胞增生李斯特菌易错误鉴别成英诺克李斯特菌,蜡样芽胞杆菌易错误鉴别成蕈状芽胞杆菌,阪崎肠杆菌易错误鉴别成河生肠杆菌。结论 80%以上的疾病预防控制中心对6种致病菌的定性检验能力较好,可以满足食品安全风险监测的需求。其中对沙门菌的检验能力最高;金黄色葡萄球菌漏检率较低但易出现多检;大肠埃希菌的检验能力有待提高;阪崎肠杆菌的检验水平较2010年结果有明显提升。     

Development of an immobilization and detection method of Enterobacter sakazakii from powdered infant formula

Enterobacter sakazakii is an emerging opportunistic pathogen that is associated with rare but life-threatening cases of meningitis, necrotizing enterocolitis, and sepsis in premature and full-term infants. In the present study, a procedure was developed for immobilization of E. sakazakii with zirconium hydroxide coupled with detection by a species-specific duplex PCR, based on 16s-23s rDNA internal transcribed spacer (ITS) and ompA gene. Specificity of duplex PCR was tested against two-type strains, six isolates of E. sakazakii and other eight non-E. sakazakii species. When pure culture of E. sakazakii was used for immobilization, total recovery rate ranged from 79.4% to 99.6% of input bacteria, and the detection limit of duplex PCR was 3x10(5)CFU/ml. Different levels of E. sakazakii were inoculated into 90ml reconstituted powdered infant formula (PIF), and detection limit of duplex PCR was 3x10(0)CFU/ml with 24-30h enrichment after immobilization. When the experiment was performed in the presence of 10(2)CFU/ml Salmonella typhimurium, the detection limit of duplex PCR was not affected after enrichment. Seven out of 13 commercial PIF were detected positive by duplex PCR after immobilization, while only three were positive by biological methods. This study demonstrates that the combination of immobilization method with duplex PCR is easy, rapid, and efficient, and may have applications for the detection of E. sakazakii in more PIF samples.     

巧克力中沙门氏菌检验能力验证的分析

目的分析参加中国食品药品检定研究院组织的NIFDC-PT-135巧克力中沙门氏菌检验能力验证实验结果。方法巧克力样品的前处理按照作业指导书要求进行,沙门氏菌的分离及鉴定按照GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验》进行,传统生化试验结合VITEK 2鉴定结果进行综合判定。结果 CODE0559样品中检出沙门氏菌属,CODE0205样品中检出肠沙门氏菌双相亚利桑那亚种,CODE0863样品中未检出沙门氏菌, 3个样品能力验证结果均与组织方一致。结论基于国标法检测沙门氏菌时,应综合使用几种分离平板,传统生化试验并结合VITEK2作为辅助检测,以确保检测结果的准确性。     

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

旨在建立针对阪崎肠杆菌的双重荧光PCR快速检测方法。以阪崎肠杆菌局部大分子合成(MMS)操纵子和外膜蛋白A(ompA)为靶基因,建立双重荧光PCR反应体系,探讨该体系的特异性、灵敏度和抗干扰能力。结果表明,双重荧光PCR体系对阪崎肠杆菌的灵敏度为4.3×103 CFU/mL,人工污染初始菌量为2 CFU/100 g奶粉样品增菌24 h即可检出;39株实验菌中的15株阪崎肠杆菌出现特异性扩增,24株非阪崎肠杆菌未出现特异性扩增。本研究所建立的双重荧光PCR体系特异好、灵敏度较高及抗干扰能力强,可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

恒温荧光核酸检测仪检测2种食源性致病菌的方法验证

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察恒温荧光核酸检测仪(constant temperature fluorescent nucleic acid detector)检测食品(自然食品和加标食品)中食源性致病菌如阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的一致性。方法通过对食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌国标培养法和恒温荧光核酸检测仪方法检测结果的比对,考量后者方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率和准确度。结果恒温荧光核酸检测仪检测食品中阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度和特异性都是100%,假阴性率为0;假阳性率为0。结论恒温荧光核酸检测仪方法特异性强、准确度高、无一例漏检。     

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒

目的 以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing, SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测致病菌志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM,以及阪崎肠杆菌的一致性。方法 以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法。,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157：H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157：H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有高灵敏度、特异性强、准确度高,无一例漏检。     

市售生鲜鸡肉5 种主要食源性致病菌污染检测及分布概率评估

采用聚合酶链式反应技术对上海市52 个市场的208 份鸡腿、鸡爪、鸡翅、鸡胗、鸡胸肉中出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌5 种食源性致病菌进行快速检测,以了解不同鸡肉食用部位各种致病菌的分布规律,并根据β概率分布确立最具代表性的部位作为评估靶点。结果显示：在208 份样品中,大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌未检出;阪崎肠杆菌在鸡翅中检出1 株;志贺氏菌检出2 株,分布于鸡翅、鸡胗;单增李斯特菌检出11 株,检出率达5.29%,且在鸡翅中检出率最高（4 株）,鸡腿（3 株）、鸡爪（3 株）部位检出率相当,鸡胗检出率最低（1 株）。     

奶粉中一株阪崎肠杆菌的鉴定及其挥发性产物分析

目的鉴定奶粉中一株阪崎肠杆菌分离菌株F2-1,采用顶空气相色谱-质谱联用法(headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-MS)分析分离菌株F2-1在液态培养中产生的挥发性代谢产物。方法应用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统分析分离菌株的生理生化特征;利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)特异性扩增检测分离菌株的16S rDNA,通过HS-GC-MS分析分离菌株F2-1代谢的挥发性产物。结果分离菌株F2-1为革兰氏阴性菌,生理生化特征与阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii,ES)的相似性为99%,LAMP检测进一步确认为阪崎肠杆菌,分离菌株F2-1在营养肉汤中代谢的挥发性产物主要有异戊醛、乙醇、异戊醇、3-羟基-2-丁酮、乙酸、正十五烷、正十六烷、正十七烷、1-癸醇。结论奶粉中分离菌株F2-1鉴定为阪崎肠杆菌,该菌产生的挥发性产物为阪崎肠杆菌的快速鉴定提供参考。