毕赤酵母产α-葡聚糖酶发酵工艺研究

对毕赤酵母液体发酵产α-葡聚糖酶的主要影响因子进行了研究,考察了影响外源蛋白表达的因素,包括碳氮源、pH、装液量、接种量、温度等,单因素实验结果表明最佳培养及发酵条件为：最佳碳源氮源分别为甘油和YNB,甲醇诱导浓度为1．5％,pH为5．5～6．0,装液量为25mL／250mL,接种量为10％,表面活性剂为0．2％,摇床转速为200r／min。菌株的产酶水平由原来的47．50U／mL提高到73．16U／mL,酶活力提高了约1．5倍。     

重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究

研究了毕赤酵母高密度发酵组成型表达α-葡聚糖酶,从6.8 L发酵罐逐级放大至5000 L发酵罐的放大工艺。采用恒定p H和控制甘油残留浓度和溶解氧相结合的调控策略,进行了多批次的发酵试验。结果表明:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动的α-葡聚糖酶的生成具有生长偶联特征,集中在对数生长期和稳定期。6.8 L发酵罐中上清酶活达1253 U/m L,中试放大至50 L发酵罐中产酶最高达1300 U/m L,500 L发酵罐中酶活为740 U/m L。5000 L规模发酵罐中产酶达到589 U/m L。建立了以甘油作为碳源,发酵调控简单的工艺,避免了使用甲醇带来的安全问题,适合放大生产。     

杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究

重组甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）工程菌PMADl6／pMETA-Lccl能分泌表达杂色云芝重组漆酶。本文通过对其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达漆酶的最适培养条件：在BMMY培养基中添加0．2mmol／L的Cu^2＋．装液量为25mL／250mL三角瓶，接种量体积之比为45：25，0．5％甲醇诱导，20℃条件下摇瓶培养5d，漆酶最高酶活力达1192U／L。     

重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶

采用含黑曲霉(Aspergillus niger)纤维二糖酶基因的重组毕赤酵母发酵生产纤维二糖酶,对重组酵母的基因表达调控及发酵性能进行了研究。摇瓶试验结果表明:产酶培养基中甘油和玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%和3.0%,培养基最适pH值为6.0。甲醇作为碳源和基因表达的诱导物,对重组毕赤酵母的发酵结果有重要影响。发酵过程中每24h加入体积分数为1.0%的甲醇、质量浓度为0.2%的甘油及质量浓度为0.3%的玉米浆粉,有利于重组毕赤酵母持续合成纤维二糖酶。摇瓶发酵8d,发酵液中纤维二糖酶活力可达到9.01 IU/mL。     

Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制

在采用Muts 表型基因重组巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)发酵生产血管生长抑制因子(angiostatin)的过程中 ,诱导表达阶段甲醇的质量浓度对血管生长抑制因子的表达至关重要 .因重组Muts 型巴斯德毕赤酵母利用甲醇极慢 ,按文献方法流加甲醇时 ,甲醇逐渐积累达 30 g/L ,血管生长抑制素表达水平仅为 4mg/L .采用甲醇检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后 ,甲醇质量浓度可稳定控制在设定范围 .采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加 ,同时手动流加适量甘油以促进细胞生长 ,血管生长抑制因子表达水平量最高可达 89mg/L .     

漆酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝RNA为模板,通过RT—PCR获得不带自身信号肽漆酶Lccl基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMETαA—Lccl,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母菌株,漆酶酶活力达78U／L。     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

α-1,6-葡聚糖酶是专一作用于α-1,6糖苷键产生小分子葡聚糖的一类水解酶,广泛的运用于制糖工业和啤酒工业中。采用PCR法扩增朱黄青霉（Penicillium minioluteum）C12114的α-1,6-葡聚糖酶基因,将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9K。经SacI酶线性化电击转入毕赤酵母基因组,构建重组酵母GS115/pPIC9K-dex。对构建成功的转化子进行1.5%的甲醇诱导表达,在30℃条件下培养7d时酶活达到最大值,为88.35U/mL。      

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵条件的优化

对1株产纤溶酶毕赤酵母工程菌菌株pk53,利用单因素试验和正交试验确定该菌株的适宜廉价发酵培养基为:麸皮1.5%,豆粕粉2.0%,KH2PO40.5%,MgSO4.7H2O 0.05%;发酵条件为:接种龄14 h,接种量1%,甲醇添加量1.5%,培养基装液量30 mL(250 mL三角瓶),生长pH为5.5,诱导pH为6.0;在此条件下培养,纤溶酶酶活力达429.06 U/mL,是初始发酵条件下酶活力的8.88倍。     

牛肉风味强化肽表达条件的初步研究

牛肉风味强化肽(BeefyMeatyPeptide,BMP)最初是从牛肉的消化液中分离的八肽,能增强鲜味,可作为一种类似于谷氨酸钠的天然风味强化剂。文章介绍了利用基因工程技术在酵母菌中表达BMP的方法,对构建的Pichiapastoris酵母工程菌株X-33/pPICZαA-BMP进行了发酵表达,确定了菌株的表型、高密度生长及表达条件。试验结果显示:构建的工程菌株为甲醇利用慢表型Muts,优化后的种子培养基摇瓶条件下菌体密度OD600达到28。在pH3.0、诱导72h、甲醇添加量为0.5%的条件下BMP有最大表达,选用BSM有利于诱导表达BMP;建立了SephadexG-25分离纯化、RP-HPLC检测BMP的有效方法。     

响应面法优化CALA在毕赤酵母中的组成型表达

南极假丝酵母脂肪酶A (CALA)是现有研究中唯一一种对甘油三酯sn-2位显示出偏好的脂肪酶.本文在完成CALA在毕赤酵母中组成型表达的基础上,为了提高CALA的酶活,采用响应面法建立了CALA发酵培养基和培养条件的二阶数学模型,并验证了模型的有效性;筛选出了2个影响毕赤酵母发酵产CALA的主要因素:培养温度、葡萄糖含...     

毕赤酵母表达鼠李糖苷酶的甲醇流加方式优化

利用毕赤酵母发酵生成鼠李糖苷酶。依据已有毕赤酵母发酵动力学模型,设定最优化问题。根据泛函极值存在必要条件,将最优化求解问题转换为微分代数方程求解问题。利用迭代循环确定最优乘子并求解最优甲醇流加轨迹。实验证明,由此种方法获得的甲醇流加速率曲线,可以使毕赤酵母表达的鼠李糖苷酶产量有所提高。      

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒是\     

α-葡聚糖酶的酶学性质初步研究

α-葡聚糖酶能够很好地解决制糖工业中的葡聚糖问题,在制糖工艺过程通过添加α-葡聚糖酶去除α-葡聚糖是目前最佳选择。本文初步研究了基因工程菌株GSll5-dex生产的。α-葡聚糖酶的酶学性质。结果显示：该酶的最适反应温度为50℃;最适反应pH为5．0;FeH、Mg2＋和Co2＋对酶有激活作用,Ca2＋、Kr＋、Zn2＋、Na＋、Al3＋的作用不明显,而Cu2＋、Ba2＋、Fe2＋、Sn2＋、Ag＋对酶有抑制作用;30℃以下保存28h酶活损失很小,而40℃保存16h,就已损失60％,在45℃保存30min,就已损失56％,保存温度越高,酶活损失越快;该酶在pH为4～6的范围内较稳定,高浓度蔗糖对该酶起到很好的保护作用,甘油次之,氯化钠基本没有保护作用。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究

探讨重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的特性,以期能够通过基因工程和发酵工程技术大规模的生产活性重组藻蓝蛋白。先用甘油作碳源培养重组巴斯德毕赤酵母工程菌,达到一定生物量后,再用甲醇诱导外源重组藻蓝蛋白基因的表达,并测定了甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化。结果表明:所获得的细胞干重最高达41.93g/L,细胞光密度最高为182.77,藻蓝蛋白的最高产量为61.20mg/L,分泌到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为24.32mg/L。该研究为实现藻蓝蛋白的产业化生产奠定了良好的基础。