壳聚糖复合纳米基因载体的制备

目的制备壳聚糖复合纳米基因载体,并探讨其理化性质、细胞毒性、稳定性及体外转染效率。方法采用复凝聚法制备包封聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)/DNA复合物的壳聚糖复合纳米基因载体,用纳米粒度分析仪测定其粒径和Zeta电位;透射电镜观察其形态;MTT法检测其细胞毒性;在PBS溶液(pH 7.4)及含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,于37℃条件下放置0、1、3、5 d,1%琼脂糖凝胶电泳检测其稳定性;体外转染CNE细胞,评价其转染活性。结果当N(PEI的氨基)/P(DNA的磷酸根)≥6时,能够形成稳定的壳聚糖复合纳米粒,平均粒径约为300 nm,表面电荷约为30 mV;壳聚糖复合纳米基因载体呈球形,圆整且分散性好;复合纳米基因载体的细胞毒性较低;1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,DNA被完全包裹在复合纳米载体中,且5 d内无游离DNA释放;体外转染活性与壳聚糖/DNA复合物相比,提高了约1 000倍,且转染能力不受血清的干扰。结论制备的壳聚糖复合纳米基因载体是一种高效、低毒的非病毒载体,具有作为体内基因治疗载体的应用潜力。     

精氨酸修饰的磁性纳米基因载体的研究

采用多层修饰方法制备出精氨酸修饰的磁性纳米基因载体,对样品进行了粒度分析、Zeta电位分析、耐酸性能、生物相容性、体外细胞转染性能研究。结果显示,精氨酸修饰的磁性纳米颗粒均匀,分散性好,大多呈圆球型,平均粒径为15 nm,粒径范围10~20 nm,其Zeta电位为+29.3 mV;多层修饰的纳米磁粒在pH 2.0的酸中具有很好的耐酸性能,而未处理的纳米粒子在酸溶液中发生了溶解。MTT实验结果显示,纳米颗粒与细胞有良好的生物相容性;体外细胞转染的结果表明,精氨酸修饰的纳米磁粒能介导pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞,并在细胞中表达绿色荧光蛋白。因此,精氨酸修饰的磁性纳米颗粒作为一种新型非病毒基因载体具有介导核酸类生物大分子的应用价值。     

蛇毒类凝血酶基因真核表达载体的构建

目的 构建大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin,GSB)基因真核表达载体,试图借助IL-2的分泌通路,使GSB分泌至胞外而达到溶栓和防栓的目的。方法 应用PCR重组技术,将GSB的5’端和3’端分别与IL-2基因的信号肽和poly A尾相连接,将此重组基因克隆入逆转录病毒载体 pLNCX,以脂质体介导转染人外用血淋巴细胞,并以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因检测转染效率、确定DNA和脂质体的比例。转染24h后从mR-NA、DNA和蛋白质水平检测GSB的表达情况。结果 mRNA和DNA水平均有外源基因GSB的表达;SDS-PAGE显示在相对分子质量 30 000左右出现一条带,且转染上清具有精氨酸酯酶活性。结论 构建的真核表达载体可表达具有活性的GSB,为GSB基因治疗血栓的体内研究打下基础。     

慢病毒载体及其应用的研究进展

与其他载体相比,慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点,现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。     

双氨基甲酸酯键连接的阳离子类脂前体合成

随着生物化学与分子生物学理论的不断发展，基因治疗已成为医学界最活跃的研究领域之一。基因治疗载体在基因治疗过程中起一个转运和保护的作用，是基因治疗成功与否的关键。因此，基因治疗载体的开发对基因治疗的发展尤为重要，其有效开发将推动基因治疗向常规治疗方法的转变。目前，用于临床的基因载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类，它们都具有各自鲜明的优缺点，在临床治疗上亟需改进目。脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体，居第二位，是最有发展前景的非病毒载体。其中。阳离子脂质体由于具有对阴离子型聚电解质敏感。对带负电荷的DNA有较高的转运能力．还能转运RNA、核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞等优点，其转染效率比其他脂质体高出许多倍。因而被广泛应用于基因转移技术中。在阳离子类脂的结构中。连接键是一个非常重要的组成部分。它直接决定了阳离子脂质体的化学稳定性及被生物降解的能力，进而影响阳离子类脂的转染效率和细胞毒性141。现在已合成出来的用于基因治疗的阳离子脂质体的连接键主要有醚键（如DOTMA、DMR．IE）IS．-91和酯键（如DOTAP）两种。前者由于过于稳定，在完成转染任务后不易分解。遗留在细胞内部对细胞产生毒害；而后者由于不够稳定，在转染过程中就易分解，对细胞的转染效率产生不利影响。 因此．本课题组设计了以氨基甲酸酯键作为连接键的阳离子类脂．通过改变类脂前体分子中碳链长度、类脂分子合成中卤代烷碳链长度和卤素的类型来得到一系列的阳离子类脂，计划利用其pH敏感性和细胞内外的pH值差别，使在细胞外稳定的阳离子类脂在进入细胞内完成转染任务后可以分解成小分子有机物顺利排出，从而达到较好的转染效率和较低的细胞毒性旧。     

RhoC基因沉默对肝癌细胞增殖的影响

目的构建靶向RhoC基因的RNA干扰(RNAi)载体,并研究RhoC基因沉默对肝癌细胞增殖的影响。方法将合成的寡核苷酸片段克隆入RNAi载体,并转染肝癌细胞,以沉默RhoC基因表达,RT-PCR检测基因抑制效果。绘制生长曲线,检测转染细胞的增殖情况,FCM检测细胞周期变化。结果构建的RNAi载体有效地抑制了肝癌细胞RhoC基因的表达,RhoC基因沉默显著地抑制肿瘤细胞增殖,增殖期细胞百分数显著下降,而静止期细胞百分数显著升高。结论RhoC基因沉默能够抑制肝癌细胞的增殖,为靶向RhoC的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

作为基因载体的低分子量壳聚糖的制备及研究进展

低分子量壳聚糖作为非病毒性基因治疗载体有着广阔的前景,已成为研究的热点。综述了低分子量壳聚糖的制备方法以及载基因的研究进展,并讨论了影响转染的因素。     

阳离子PLGA纳米颗粒作为核酸疫苗递送载体的能力及其特性评价

目的对阳离子聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]纳米颗粒作为核酸疫苗载体的能力及其特性进行评价。方法采用双重乳化法制备阳离子PLGA纳米颗粒,检测其粒径分布和表面电势,获得合成的最适方案。通过考察其形貌、吸附效率、抵抗核酸酶降解能力、细胞毒性、细胞摄取及转染真核表达质粒的能力,分析其作为核酸疫苗载体的适用性及可行性。结果由两种试剂修饰PLGA制备的纳米颗粒粒径分布、表面电势及分散性最佳;透射电镜及扫描电镜下观察粒径均一且呈规则球形;对质粒DNA的吸附效率可达65%;能够有效保护吸附于纳米颗粒的质粒DNA免受核酸酶降解;两种细胞系中的细胞毒性试验均显示细胞存活率高于80%;共聚焦显微镜下可观察到其能被细胞内化;间接免疫荧光试验结果表明,其能有效转染真核表达质粒并使其正确表达。结论成功制备了具有递送核酸疫苗能力的阳离子PLGA纳米颗粒,为核酸疫苗载体的发展奠定了理论基础。     

高表达转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒的构建及鉴定

目的构建转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒,为进一步研究ZNF191的生物学功能及其在肿瘤基因治疗方面的应用奠定基础。方法从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,亚克隆至pLVX-AcGFP-N1质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确后,将含有ZNF191基因的重组质粒pLVX-ZNF191结合辅助质粒转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒,Western blot检测感染的293T细胞内ZNF191蛋白的表达。结果酶切及测序鉴定pLVX-ZNF191质粒构建正确,Western blot检测重组慢病毒能显著提高293T细胞的ZNF191蛋白表达水平。结论已成功构建了ZNF191基因重组慢病毒表达载体pLVX-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

核-壳型脂质体基因载体的研究进展

脂质体作为一种重要的非病毒基因载体,在核酸和药物转运方面有着巨大的优势和潜力。近年来脂质体基因载体的研究基础上,主要介绍了脂质体-聚阳离子-DNA复合载体(LPD)和脂质体-磷酸钙纳米粒子复合载体(LCP)两种核-壳型脂质体基因载体,展望了核-壳型脂质体基因载体的发展方向及其在基因治疗领域的应用前景。     

OMMT/NBR纳米复合材料结构与性能的研究

采用熔体插层法制备有机蒙脱土（OMMT）／NBR纳米复合材料，并对其微观结构及性能进行研究。结果表明，采用熔体法制备的OMMT／NBR复合材料，NBR大分子链插入OMMT片层中，OMMT在NBR基体中呈纳米级分散;与未加OMMT的NBR硫化胶相比，OMMT／NBR纳米复合材料的物理性能明显改善，相同剪切变形下的OMMT／NBR纳米复合材料的储能剪切模量较大；随着OMMT用量的增大，OMMT／NBR纳米复合材料的物理性能提高。     

聚丙烯纳米复合材料的研究及应用

综述了聚丙烯基层状填料纳米复合材料、纤维状填料纳米复合材料、多面齐聚硅倍半氧烷纳米复合材料的制备方法及结构与性能方面的研究进展,重点介绍了聚丙烯/黏土纳米复合材料的实际应用,纳米填料在聚丙烯纳米复合材料中的分散状况尚需进一步改善。     

喷雾干燥法制备聚氨酯/碳纳米管复合材料的结构与性能

通过喷雾干燥法制备了聚氨酯/碳纳米管复合材料。扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察结果表明,碳纳米管在聚氨酯基体中分散较好。X-射线衍射测试表明,碳纳米管对复合材料的微相结构影响较小。随着碳纳米管用量的增加,动态力学性能测试表明复合材料的耐热性有了显著的改善。另外,该复合材料还表现出多功能特性,如高导电性和导热性。随着碳纳米管体积分数的增加,聚氨酯/碳纳米管复合材料的电导率逐渐提高,填充碳纳米管的聚氨酯复合材料的导电逾渗值约为5%。     

Al2O3/SiC纳米复合陶瓷的制备及性能

在Al2O3陶瓷基体中引入第2相纳米SiC颗粒,可以改善力学性能、耐磨损性能,是陶瓷领域研究的热点之一。纳米颗粒的均匀分散和适当的成型烧结决定了其性能。本文就目前存在的Al2O3/SiC纳米复合陶瓷粉体制备方法与烧结工艺进行了详细阐述。     

HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段;分别合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS57个T或Th细胞表位基因;PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联,克隆入真核表达载体pcDNA3·1(-),并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA3·1(-)-CtEm已成功转染COS7,间接免疫荧光和RT-PCR证实,pcDNA3·1(-)-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达,为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。     

聚丙烯/粘土纳米复合材料最新进展

综述了近年来聚丙烯（PP）/粘土纳米复合材料的研究进展，插层或剥离结构的形成对于PP纳米复合材料性能的提高十分重要。PP/蒙脱土热力学相容性的改善是插层和剥离结构形成的关键因素，一般来说，PP/粘土纳米复合材料比PP的力学性能，热性能，阻燃性能，阻燃性能，阻隔性能有较大幅度的提高，是一类非常具有吸引力的新材料。     

高气体阻隔性ECO/OMMT纳米复合材料的性能研究

采用熔体共混方法制备氯醚橡胶（ECO）／有机蒙脱土（OMMT）纳米复合材料，研究其微观结构、拉伸性能和气体阻隔性能。结果表明，即使在OMMT用量较大（100份）的情况下。ECO／OMMT纳米复合材料仍能够形成插层结构≠在OMMT用量较大的情况下，ECO／OMMT纳米复合材料中OMMT聚集形成刚性很强的填料网络，使复合材料的应力一应变行为趋向于塑料和短纤维补强橡胶复合材料。同时绝大多数橡胶大分子链被分隔在OMMT片层之间，显著提高了材料的气体阻隔性能。     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

PBO纤维复合材料的研究及进展

聚对苯撑苯并二恶唑(PBO)纤维表面化学惰性较强,应用方面受到了较大的限制。PBO纤维经表面改性后可与其它化合物形成复合材料,如PBO树脂基增强复合材料以及PBO纤维纳米复合材料等,PBO纤维复合材料凭借优异的力学及化学性能在各领域都获得了较大的应用及发展。介绍了PBO树脂基增强复合材料和PBO纤维纳米复合材料的应用及发展。近些年,PBO纤维复合材料已经逐步取代传统的金属材料。但是目前PBO纤维复合材料仍有较大的研究空间,其开发对于航空、航天和国防等高新技术领域材料及产品更新换代具有重要意义。     

Dual-emission carbon dots-copper nanoclusters ratiometric photoluminescent nano-composites for highly sensitive and selective detection of Hg2+

A novel dual-emission photoluminescent (PL) nano-materials of carbon dots-copper nanoclusters (CDs-CuNCs) nano-composites is prepared for excellent sensitivity and selectivity toward Hg²⁺. The nano-composites are composed of blue photoluminescent CDs and red photoluminescent CuNCs with similar excitation wavelengths through the electrostatic assembly. The red photoluminescence of CuNCs was inhibited by the nano-composites exposed to Hg²⁺, while the blue photoluminescence of CDs remained stable. The color of the nano-composites slowly changed from pink to blue with the added of Hg²⁺ concentration. The limit of detection (LOD) of the nano-composites is 0.31 nmol/L (nM) toward Hg²⁺ in aqueous solution, when the signal to noise ratio is 3. In addition, a visual PL test paper is prepared. When the Hg²⁺ solution is added, the color of test paper transforms from pink to blue immediately. Therefore, the nano-composites are very important for efficient and sensitive detection of Hg²⁺, which show broad application prospects in environmental analysis, food safety detection, biological detection and medical diagnosis in daily life.