一种耐热性植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

采用半固态发酵方式培养泡盛曲霉(Aspergillus awamori)AS3.324,通过有机膜超滤、阴离子交换层析、凝胶层析后,得到纯化的植酸酶。酶学性质表明,其反应最适温度为50-55℃,最适pH为5.5,在37℃下以植酸钠为底物的Km值为1.03 nmol/L,Vmax为2.13μmol/(L.min)。EDTA基本不影响植酸酶活性;Ca2+,Mg2+,Mn2+对植酸酶活性有轻微的抑制作用;Fe2+,Zn2+对酶促反应有显著的抑制作用。对该酶的耐热性研究表明,经较高温度条件处理后,仍有较高残余酶活性,与当今商品化的植酸酶相比,有较强的耐热性。泡盛曲霉植酸酶作为动物饲料添加剂具有广泛的应用前景。     

阿魏酸酯酶与纤维素酶协同水解麦麸释放阿魏酸的研究

研究了重组阿魏酸酯酶和纤维素酶协同作用水解去淀粉麸皮对阿魏酸释放量的影响。以高效液相色谱法检测阿魏酸的提取量,结果显示,底物的超声预处理最佳条件为350 W,20 min,是未经超声处理的底物阿魏酸释放率的1.45倍,单独使用阿魏酸酯酶(re Ao Fae A)30 U时阿魏酸的释放率仅为4.1%,单独使用纤维素酶(r Au Cel12A)并不释放阿魏酸,当两种酶协同作用时,阿魏酸的释放率明显提高,经单因素试验确定双酶协同作用的最佳条件为:re Ao Fae A的最适添加量为30 U,r Au Cel12A的最适添加量为70 U,水解时间为10 h,水解温度为40℃,水解p H为5.0,料液质量体积比为1 g:30 m L,此时阿魏酸的释放率为23.6%。该结果表明,去淀粉麸皮中纤维素的降解,对提高阿魏酸酯酶水解释放阿魏酸效率具有重要作用。     

产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其酚酸释放研究

本文采用平板筛菌和牛津杯透明圈试验法筛选具有产阿魏酸酯酶的菌株,将其接种于麸皮中进行固态发酵,采用分光光度法和HPLC法分析发酵麸皮其阿魏酸酯酶活力、总酚酸以及阿魏酸的释放量,并进行个体形态、菌落特征和TIS测序鉴定,结果表明:筛选出一株菌株的阿魏酸酯酶酶活优于其他菌株,在发酵第4 d该菌株的阿魏酸酯酶酶活达最高为163.5 m U/g;而且发酵麸皮释放总酚酸的能力较高,将麸皮的总酚酸量提高6.6倍,其中阿魏酸的量达到0.697%,比没有发酵的麸皮阿魏酸的含量增加了0.22%。对其进行分子鉴定,该菌株与烟曲霉(Aspergillus clavatus)同源性达100%,确认为烟曲霉命名为烟青。将该菌应用于麸皮发酵提高阿魏酸含量,是农副产品增值利用以及药用功能开发的主要研究方向。     

浓香型白酒酿造过程中一株产阿魏酸酯酶菌株的筛选和鉴定

本研究分别从浓香型白酒的大曲、窖泥和糟醅中筛选出一株产阿魏酸酯酶的细菌,并对其生理生化特性进行了研究.通过平板划线对目的菌株进行了分离纯化,再根据形态特征和16S rRNA 同源序列分析对分离菌株进行鉴定.结果表明,所分离筛选的产阿魏酸酯酶的菌株为考氏科萨克氏菌(Kosakonia cowani),产阿魏酸酶活为25....     

Partial Purification of Ferulic Acid Esterase from Malted Barley

A partial purification of ferulic acid esterase, which degrades feruloyl glycerol, has been achieved from barley malt in small yields. Coloured and viscous materials were removed from the malt extract using batch‐elution anion exchange chromatography. Further steps included gradient elution anion exchange chromatography and gel filtration chromatography. Estimations of the molecular weight varied greatly from 22KDa to 158 KDa, possibly because the protein interacted with the matrix of the gel exclusion chromatography column and because multiple forms of the enzyme were present. The partially purified feruloyl esterase had an apparent Km of 0.46% feruloyl glycerol. However more than one enzyme may be present and the substrate contains two isomers and so Michelis‐Menten kinetics may not be appropriate.     

深绿木霉嗜酸性阿魏酸酯酶酶学性质及生物质转化分析

为实现生物质的高效降解,制备具有重要生理功能的阿魏酸,本实验从深绿木霉XS6发酵液中分离纯化深绿木霉阿魏酸酯酶（Trichoderma atroatroviride feruloyl esterase,TaFAE）,并研究酶学特性。发酵液经(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Cellulose DE52阴离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析后,得到电泳纯的TaFAE,比活力134.3 U/mg,回收率28.9%,纯化倍数31.52。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得酶分子质量约为66.4 kDa。TaFAE对阿魏酸甲酯亲和力最高,以其为底物,酶Km值和Vmax值分别为0.53 mmol/L和16.74 μmol/（min·mg）。以芥子酸甲酯为底物,酶促反应速率最大,达到32.21 μmol/（min·mg）,是阿魏酸甲酯的2 倍,对咖啡酸甲酯无活性,说明该酶具有严格的底物特异性。TaFAE最适pH值和温度分别为pH 4.0和40 ℃。在pH 2.0～9.0的范围内,30～40 ℃温度下都表现出良好的稳定性。金属离子Ca2＋和Mg2＋对TaFAE活性有显著激活作用,重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活性;β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、十二烷基硫酸钠、Trition X-100增强酶活性,苯甲基磺酰氟有较强的抑制作用。木聚糖酶降解生物质的体系中加入TaFAE可显著增加阿魏酸和还原糖产量,表明TaFAE和木聚糖酶有良好协同作用。综上所述,TaFAE优良的耐酸性及其他酶学性质说明其在食品和饲料行业有较好的应用潜力。     

小麦与小麦芽阿魏酸酯酶酶活力的测定及其酶学性质研究

以阿魏酸乙酯作为底物,确定了阿魏酸酯酶的酶解工艺条件:酶解时间100 min;酶液与底物的体积比为0.75;提取液pH值6.2。针对阿魏酸酯酶酶学性质的研究表明:最适温度60℃,30～35℃范围内热稳定性较强,保温60 min后其活力可保持在80%以上;最适反应pH值5.0,在pH值5.0～5.6范围内对阿魏酸酯酶的破坏力相对较小,保温60 min其活力仍可保持在80%以上;Cu2+和Zn2+对阿魏酸酯酶有强烈的抑制作用,而ED-TA则对其有明显的促进作用。对5种小麦及其麦芽的阿魏酸酯酶酶活力进行测定:麦芽中的阿魏酸酯酶酶活均高于小麦,其中以烟2415、鲁麦21、郑麦004变化较大。     

泡盛曲霉产菊粉酶发酵条件的探究

由山东滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤中分离得到高产菊粉酶的菌株,经形态学观察、18S rDNA全序列分析,初步鉴定该菌为泡盛曲霉（Aspergillus awamori SD1222）。采用单因素试验和正交试验对其进行了产酶条件优化,确定该菌株产菊粉酶的发酵条件为：菊粉浓度30g/L,蛋白胨浓度6g/L,氯化钠浓度7g/L,250mL锥形瓶中的装液量为40mL,初始pH值为5.0,30℃下160r/min振荡培养72h。     

泡盛曲霉发酵麦麸过程中酚类物质含量的变化与三种酶活性的相关性

本研究以小麦麦麸为原料,分别采用3株泡盛曲霉(分别为GIM3.266,GIM3.4,GIM3.5)进行连续8天的固态发酵,每天分别提取发酵过程中小麦麦麸中不同存在形态酚类物质并测定其含量,同时,每天测定3株泡盛曲霉在发酵过程中木聚糖酶、纤维素酶以及阿魏酸酯酶的活性变化。结果表明,与未经发酵的麦麸相比,经泡盛曲霉发酵后的麦麸游离型酚类物质的含量显著增加,总酚含量可高达11561.30μg/g麸皮,比发酵前的麸皮总酚提高了169%;另外,酶活力的结果表明:纤维素酶活力在发酵前三天显著增大,其活力最高可达156.70 U,木聚糖酶活力随总酚释放量的增加而增加,最高可达34123.00 U,阿魏酸酯酶活力在发酵中后期达到顶峰,最高可达2642.60 U。总体而言,麦麸发酵过程中酚类物质的释放量与木聚糖酶和阿魏酸酯酶的酶活力呈正相关,说明发酵后麦麸中酚类物质提取量的显著增加与这两种酶密切相关,这两种酶活力高的泡盛曲霉菌株,更有利于释放麦麸中的酚类物质。     

Partial Purification of Acetic Acid Esterase from Malted Barley

Partial purifications (84, 114 and 390 fold) of a soluble acetic acid esterase from barley malt that degrades diacetin have been achieved. Enzyme recoveries were 20%, 20% and 25% in three consecutive runs. Initial problems of high viscosity and colour in the extract were overcome with the use of batch‐elution anion exchange chromatography. This was followed by gradient elution anion exchange chromatography and gel filtration chromatography, which gave the greatest purification, but which gave erratic estimates of the molecular weight of the enzyme (40, 48 and 84 kDa). The apparent Km value of the acetyl esterase was tentatively estimated to be 25mM diacetin.     

采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建

为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈,本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR,从糖化酶基因(glaA)高效表达的泡盛曲霉菌株SG1 基因组DNA 扩增获得glaA 2.1 kb 启动子片段(包含信号肽编码序列)及1.1kb 终止子片段,构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302 为基础,删除非必需区段及多余限制酶位点,插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1 的潮霉素抗性标记,构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21 个转化子/106 分生孢子,而农杆菌介导法可达1106 个转化子/106 分生孢子,是原生质体法的53 倍。构建载体成功利用glaA 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性,可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。     

两种丝状真菌发酵小麦麸皮中酚酸的释放及与阿魏酸酯酶和木聚糖酶的关系

为了评价两种丝状真菌对小麦麸皮降解能力,以及对酚酸释放能力的差异,本实验在不同时间进行总酚和9种酚酸组分的变化监测并且结合阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性,电镜观察小麦麸皮表面结构对黑曲霉和棒曲霉进行综合评估。黑曲霉发酵7 d阿魏酸含量达到416.56μg/g麦麸。次之是没食子酸,从7.71μg/g麦麸增加到105.77μg/g麦麸。棒曲霉阿魏酸含量达到200.81μg/g麦麸。次之是丁香酸,没食子酸,对羟基苯甲酸和香豆酸,从分别从原麦麸中含量14.7μg/g麦麸、7.71μg/g麦麸、8.57μg/g麦麸和5.62μg/g麦麸增长至88.4μg/g麦麸,60.38μg/g麦麸,55.56μg/g麦麸,52.93μg/g麦麸。黑曲霉对麦麸的降解能力及对阿魏酸和没食子酸的释放能力都显著优于棒曲霉,而对丁香酸的释放能力略差于棒曲霉。电镜结果显示,黑曲霉降解能力优于棒曲霉。     

阿魏酸酯酶功能特性及应用概述

阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase,FAE)广泛存在于自然界,属于羧酸酯水解酶的一个亚类.经过一系列反应,其能将天然半纤维素和果胶中的酚酸、阿魏酸(ferulic acid,FA)及对香豆酸等释放出来,是一种具有应用潜力的酶.因此,各行业通过相关科学技术来利用FAE,以获得如人畜食品、纸浆和纸张、燃...     

阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达

利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因（faeA）的编码区,构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA基因整合到糖化酶基因位点的同源重组转化子4株。在酶摇瓶发酵条件下,重组菌株培养液上清中的阿魏酸酯酶活性最高达18.6mU/mL。SDS-PAGE分析显示,4株重组菌株都有约36ku目的蛋白条带,表达量为188²62μg/mL。结果表明,实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。      

阿魏酸酯酶的制备

阿魏酸酯酶是一种新型酶制剂,在食品、饲料和造纸工业中都有着广阔的应用前景,但目前还没有工业化产品。文中研究了超滤和冷冻干燥制备阿魏酸酯酶的工艺条件,结果表明,酶液pH值为8.06时有利于酶蛋白截留;装液厚度为6mm时,酶粉剂冷冻干燥时间为24h;添加1%～2%的聚乙二醇可以保护酶液在冷冻干燥过程中不失活;阿魏酸酯酶的液体和固体产品在保存过程中均表现出了较好的稳定性。     

高产单宁酶泡盛曲霉Aspergillus awamori FUYN206的筛选及所产胞外单宁酶的稳定性研究

首次从云南红茶中分离筛选到1株高产单宁酶的真菌菌株Aspergillus awamor,其在pH5.0、30℃培养72h后所产胞外单宁酶活力达162.84U/mL。酶活稳定性研究表明,该菌株所产胞外单宁酶在储存4和12周后仍保存98.02%和90.49%的酶活力;所产胞外单宁酶最适酶促反应温度为40℃,且耐高温性能优越,90℃水浴1h仍保留有88%的酶活;pH3.0～6.5范围内酶活均较稳定,酶促反应最适pH5.5;K+、Ag+、Zn2+等金属离子能促进胞外单宁酶酶促反应,而Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+等金属离子在不同程度上抑制酶促反应,其中Co2+、Cu2+的抑制作用最强。      

猪肝中提取纯化动物酯酶的研究

本实验探索了一种从猪肝中提取纯化动物酯酶的有效方法,从而为农药残留的动物酯酶检测提供了一种廉价酶源。将所制动物酯酶液用于检测毒死蜱的结果表明,其检测效果良好,所制动物酯酶具有实用价值。     

高产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其固态发酵的研究

从自然界中采集土壤样本,使用阿魏酸乙酯为唯一碳源的选择性培养基;进行初筛、固态发酵产酶试验、复筛得到1株高产阿魏酸酯酶的菌株,通过形态学观察鉴定为黑曲霉。对该菌株固态发酵产阿魏酸酯酶的培养条件进行了研究,单因素实验结果表明,相同汽爆条件下汽爆稻草的发酵产酶酶活较高;在固液比1∶3、初始pH3、麸皮添加量25%、30℃下发酵3d后酶活最高,可达445.1mU/g。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺能够促进酶的活性,其中Ca²⁺激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

横梗霉产酯化酶的纯化及酶学性质

在研究浓香型白酒的过程中为了提高出酒率以及优质酒率可以从酯化酶的研究入手,酯化酶对提高出酒率和产优质酒有着积极的影响。本实验从五粮液大曲中经过严格的筛选得到一株高产酯化酶的菌株横梗霉。纯化分离横梗霉酯化酶发酵液使用盐析、透析、层析等步骤得到纯化的酯化酶,纯化提高到35.66倍,且具有2.54%的活性回收率,相对分子质量约为43000 u。通过酶学性质研究得出,酯化酶作用时的最佳温度是40℃,存在热敏感特性;60℃条件下反应30 min后有67.97%酶活残留;当p H为6～8时,酶活性较佳,当p H达到7.5时,最优;使用纯化后的酯化酶进行酶学性质研究发现金属离子对酯化酶有抑制作用的是Fe~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)对酯化酶。得到结论该横梗霉所产的酯化酶有着高产、耐热性差、对热敏感、具有良好的耐碱性的性质,在使用过程中应该注意高温以及酸性环境对活性的影响。