人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式。方法设计引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc。通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7及c2c12细胞系,检测荧光素酶的表达情况。结果构建的pGL3-PGC-1α-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域(-2533⁺78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533+78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533⁺78)具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点。     

探索miR-145介导的黑青斑河鲀IFN-γ对MHC II的精细调控

哺乳类miR-145通过作用于MHC II的反式作用因子CIITA对MHC II的表达进行调控。为探讨在黑青斑河鲀中miR-145是否对CIITA基因存在直接调控作用,进而间接调控MHC II的表达,将黑青斑河鲀CIITA的3′非编码区(3′UTR)序列亚克隆至pMIR-Report载体中,通过双荧光素酶报告系统研究两者是否存在直接的靶标作用。结果表明:将miR-145类似物和构建的CIITA3′UTR载体共转染至Hela细胞后,荧光素酶活性没有出现预期的下调,反而出现上调;增大或减少miR-145的转染量,荧光素酶活性的变化幅度也会随之改变。将miR-145类似物和构建的CIITA3′UTR载体共转染至COS-7细胞,荧光素酶的活性没有改变。离体转染miR-145到河鲀原代脾细胞中,检测MHC II基因的表达水平也没有变化,表明miR-145确实对河鲀CIITA没有靶标作用。     

IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达

对造血调控中发挥重要作用的IKAROS基因亚型IK4进行突变,并构建重组逆转录病毒表达载体及使其在白血病细胞中表达。采用重叠延伸PCR定点突变技术,成功构建了4个IK4单突变或多突变突变体。将这4个突变体克隆至Pmscvpuro逆转录病毒载体中,构建重组蛋白表达载体。基因测序验证突变序列正确后,将重组逆转录病毒载体与病毒包装质粒VSVG、Gag-Pol共同感染293T细胞,过滤收集病毒上清,将病毒上清转染白血病NB4细胞。用Puromycin对细胞进行筛选,并通过Western印迹法对突变体表达细胞系进行验证。通过重叠延伸PCR法成功构建了4个IK4的定点单突变和定点多突变体,利用逆转录病毒介导的转染方法使IK4的4个突变体在白血病细胞中成功稳定表达,为后续的功能和机制的研究奠定了基础。     

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。     

以大肠杆菌为底盘细胞构建XylR-Pu线路检测2,4,6-三硝基甲苯

目的:恶臭假单胞菌中的TOL质粒上的XylR-Pu是经典的甲苯代谢通路,在甲苯类化合物存在时,调控蛋白XylR可以特异性的激活Pu启动子,进而启动相应甲苯代谢通路的表达。基于合成生物学的思想,优化设计此通路并导入遗传背景清楚、操作简单的大肠杆菌中构建全细胞生物传感器,用于检测环境污染物2,4,6-三硝基甲苯(TNT)。方法:以pETDuet-1为载体骨架,构建了XylR-Pu基因线路,并以绿色荧光蛋白GFP为报告分子,GFP的荧光值可以指征结合诱导剂后的XylR蛋白对Pu启动子的诱导强度,并在基因线路中加入四串联终止序列来降低背景值。最后对XylR蛋白的信号识别区进行连续易错PCR,构建随机突变体文库,从中筛选具有更高感应强度、更好灵敏度及特异性的调控蛋白。结果:四串联终止序列可有效降低XylR-Pu通路的背景值,随机突变体文库中筛选出的生物元件eX0-4,对TNT表现出良好的感应强度、灵敏度及特异性。结论:XylR蛋白在大肠杆菌中对硝基甲苯响应不明显,但筛选得到的突变蛋白eX0-4,为后续生物传感器的更深层次地开发提供了优良的元件储备。另外,利用易错PCR构建随机突变体文库从中筛选发挥预定功能的突变蛋白质也可成为挖掘生物元件的一种通用方法。     

抗狂犬病病毒单链抗体的筛选及鉴定

目的:利用噬菌体展示技术构建的噬菌体抗体库,筛选、表达及鉴定具有体外中和活性的抗狂犬病病毒单链抗体。方法:以21份接受狂犬病病毒疫苗免疫的健康人外周血构建的抗狂犬病病毒scFv噬菌体免疫库为基础,免疫管包被纯化狂犬病病毒颗粒,通过三轮筛选,ELISA检测单克隆噬菌体抗体颗粒的阳性率,DNAStar和Vbase2对阳性克隆进行序列分析。序列正确的单链抗体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达单链抗体。经压力破碎、镍亲和层析对表达的蛋白进行纯化。RFFIT检测纯化蛋白对狂犬病病毒的体外中和活性。同时使用间接ELSIA检测获得的scFv对3aG,CVS,CTN及PV株的交叉反应性。结果:共获得40个阳性、基因测序结果正确的单链抗体。其中7个获得原核表达菌株,但只有3个获得较高的可溶性表达。RFFIT结果表明有4个scFv比活大于500 IU/mg。7个scFv对4种病毒株均有一定的交叉反应。结论:成功从该scFv噬菌体免疫库中筛选出特异性scFv;RFFIT结果表明获得的scFv具有体外中和狂犬病病毒的活性。     

鹅CYP2C45基因核心启动子的鉴定及其多态性与产肝性能的关系

鉴定鹅CYP2C45基因核心启动子序列,并筛选其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,比较等位基因的转录活性差异及其与肝重性状的相关性,进而为肝重性状的选育筛选新的分子标记。通过双荧光素酶报告基因载体系统鉴定鹅CYP2C45基因启动子转录活性区域;通过PCR-SSCP、测序和序列比对方法分析朗德鹅的CYP2C45基因SNP,并分析不同基因型的转录活性;使用SPSS软件分析不同基因型与产肝性能的关系。结果表明通过双荧光素酶报告基因载体系统分析,发现鹅CYP2C45基因启动子活性区域为-165~+38bp;对朗德鹅群体进行了该区域SNP筛查,在5′上游-93bp处发现1个T/C突变,造成了屠体重的显著差异,对该突变造成的不同突变型进行转录活性分析,发现转录活性存在差异但未达到显著水平,推断CYP2C45基因的转录水平与鹅产肝性能呈正相关。本研究发现鹅CYP2C45基因核心启动子区域为-165~+38bp,该区域存在1个SNP,且与屠体重显著相关。     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

PAB-Gal4-DBD-HA-Twist重组质粒的制备

目的:构建人Twist基因的表达载体pAB-Gal4-DBD-HA-Twist,为研究其转录调控机制提供实验工具。方法:重组克隆质粒pcDNA-Flag-Twist用含有特异BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物进行聚合酶链反应;对含有两种酶切位点的目的 Twist基因片段和pAB-Gal4-DBD-HA载体进行酶切、分离、回收纯化、连接后转入感受态DH5α中,细菌培养,菌落聚合酶链反应、测序鉴定。结果:鉴定结果显示,Twist基因正确克隆到PAB-Gal4-DBD-HA表达载体,并且转入了大肠杆菌中。结论:成功构建了人twist基因PAB-Gal4-DBDHA-Twist表达载体,为进一步研究其表达、调控、作用机制奠定基础。     

钢铁企业PM_(2.5)污染情况分析及防控措施研究

介绍了PM2.5概念、组成、来源及危害,从太原市的地形、地貌、气象特征对PM2.5的影响方面进行了论述,对钢铁企业排放PM2.5的主要工序进行了分析,并针对太钢当前PM2.5的防控措施提出了一些建议。     

中国土建类专业评估认证与注册师制度回顾与思考

专业评估认证已成为教育界和关心教育人士议论的热门话题之一。土建类专业评估认证是中国开展得最早的专业评估认证,有近20年的专业评估认证的经验。文章分析了中国土建类专业评估认证的基本情况、中国建设行业注册师制度情况、对专业评估认证及注册师制度的思考,以及完善建设行业注册师制度的建议。     

特雷克斯(Terex)主要并购整合历程与成就研究

特雷克斯是一家经营方式独特的跨国公司,1986年创建于美国特拉华州.凭借其独特的收购兼并经营方式,在工程机械领域迅速扩张,不断将世界各地有名的单一工程机械品种生产商整合在自己的品牌下.     

基于城乡一体的规划和管理的转型及重构——南京浦口地区规划实践和探索

2008年1月1日开始实施的《中华人民共和国城乡规划法》,建立了由城镇体系规划、城市规划、镇规划、乡规划和村庄规划构成的我国法定城乡规划体系,标志着我国城乡规划在法律制度上迈上了一个新台阶.新的城乡规划法,打破了长期存在的城乡二元分治情况,加强城乡统一规划管理,促进了城乡经济社会全面协调可持续发展.但同时它仅仅只是解决了城市和村镇的统一规划问题,对于存在于乡村地区的大量的自然,历史等资源的规划和保护,利用的问题,并没有纳入统一规划和管理,本文通过结合南京浦口的规划实践工作,提出基于城乡一体的规划编制设想,目的旨在探索地方层面的规划编制如何能进一步结合地区管理需要,实现规划与管理的无缝对接,充实和完善城乡规划体系.     

小城镇发展与水土流失治理

建设与发展小城镇,其目的在于集中人口、控制人口、改善环境、发展经济、增强国力。实现人口控制、资源开发、环境保护协调发展。中国要发展,环境要改善,国民素质要提高,农村人口(特别是山区人口)必须聚集。小城镇的建设与发展是农业工业化、农村城市化的必然趋势,结合国家大力发展小城镇的契机,利用小城镇的建设聚集农村和山区人口,做好区域内水土流失治理具有现实意义和长远意义。     

无阀滤池在丁腈橡胶污水处理中的应用

采用GIS技术、GPRS技术及物联网传感等技术实现对城区"雨情"实时发布、"涝情"及时预警、"排涝"资源科学调度.并结合WebGIS地理技术设计和大型应用数据库系统,在此基础之上,对各种信息资源进行全面的整合和重组.本系统在东营市上线运行以来,对大、暴雨监测,多次利用排水模型进行预警,针对实时降雨强度进行报警,通过短信、LED显示大屏等多种渠道对广大市民进行提醒,对人民大众出行和生产带来了很大的方便和指导意义.     

BIM在机电安装施工管理中的应用和探索

BIM技术可以实现各专业的协同设计,可在机电安装项目中,模拟所有管线的综合排布位置和工序,并进行施工模拟,为工程实际安装阶段的工作提供更有价值的信息。该文从机电安装的角度,结合实际案例,在机电综合排布、碰撞检查等方面的应用进行了阐述,验证BIM技术在机电安装施工管理中的作用,并对BIM技术对安装工业化进程的推动作用进行了探讨。     

浅析城市市政给排水规划设计的研究与分析

在现实生活中,因为各种原因的限制以及约束,导致城市给排水规划设计存在一些没解决的问题,需要得到进一步的改善。本文首先介绍了城市市政给排水设计的一些背景,然后阐述了设计中应考虑的几点问题,希望能为同行提供一些帮助。     

我国历史文化名城名镇名村保护的回顾和展望

回顾1982年以来30年我国历史文化名城名镇名村保护发展历程,初步分为历史文化名域保护兴起、历史文化街区深入保护、历史文化名城名镇名村全面保护3个阶段.从历史文化名域名镇名村评选评价、保护体系、保护规划等方面探讨了一些概念和方法问题,并对我国今后的历史文化名域名镇名村保护提出了工作和研究建议.     

榫卯的繁简和大小

在古时候,支撑起一栋楼房的是木材,而木材与木材相连接固定的方法,就是榫卯.古时候的木匠,技艺精湛,手艺超群,在没有任何图纸的情况下,可以把楼房建造起来而不倒塌.一根根木材靠着木匠做出的榫卯搭接在一起,最后形成了亭台楼阁.榫卯作为木材和木材之间的连接点、固定点,不仅扮演着结构的角色,也扮演着美观的角色.其质量好坏直接关系到建筑的优劣,榫卯是建筑的重要组成部分,其审美功能不容忽视,它不但能体现建筑的个性和特色,还能增添建筑的美观.文章主要通过研究中国古建筑各个地方的榫卯,结合观察法、现场调研法、文献阅读法、经验总结法,分析探讨榫卯的繁简、大小与构件的承重有何种关系,得出结论并运用于毕业设计当中.