枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。     

枯草芽孢杆菌BJ3-2 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因speD的克隆与序列分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是多胺合成过程中的限速酶。根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（speD）序列设计同源引物,PCR扩增Bacillus subtilis BJ3-2gDNA,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明：B. subtilis BJ3-2 speD基因ORF为381 bp,可编码126个氨基酸,分子质量为13.87 ku,基因登录号为KJ561347,Blast比对,SAMDC基因和蛋白序列的同源性都达到90%以上。B. subtilis BJ3-2的SAMDC具有丙酮酸依赖型脱羧酶的酶原剪切结构域[GVSGVVIISESHLTIH]和保守结构域[TCG],属于典型的I类B型SAMDC家族。SAMDC在多胺生物合成过程中扮演重要的角色,是多胺合成途径中的关键酶。研究为控制发酵豆豉中生物胺含量奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌精氨酸脱羧酶基因speA的表达与蛋白纯化

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的精氨酸脱羧酶（ADC）的编码基因speA序列设计特异性酶切引物,克隆基因speA序列。测序结果显示,基因speA全长为1 473 bp,编码490个氨基酸,分子质量为58 ku。基因speA克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-speA/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,1.0 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）28 ℃诱导4 h,上清液和菌体均能表达出ADC蛋白,上清液经纯化、透析、冷冻干燥可获得纯度97%的ADC酶,酶联免疫吸附检测（ELISA）ADC酶活为16 780 U/mg。为speA基因的表达、纯化及酶学性质研究奠定了理论基础。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

土豆烧牛肉方便菜肴胀袋微生物分离鉴定及产气特性研究（网络首发、推荐阅读）

为解决土豆烧牛肉方便菜肴产品的胀袋问题,对胀袋微生物进行分离、纯化、鉴定和产气特性研究。分离、纯化得到7株优势微生物。结合形态学观察、16S rRNA序列分析及基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术鉴定分离微生物,结果显示2株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,2株为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）,2株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,1株为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。将分离菌株接种到无菌土豆烧牛肉样品中,发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）有明显产气现象,是引起产品胀袋的主要原因。     

贵州大方豆酱中优势细菌种群分析与分离鉴定

应用PCR-DGGE技术分析贵州大方县特色豆酱中细菌种群,并通过传统分离培养方法得到其主要优势菌株。PCR-DGGE指纹图谱在大方豆酱中共鉴定到食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等10种菌,其中主要优势菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,其次为乳酸片球菌（Pediococcus sacidilactici）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）;并利用传统分离培养方法在大方豆酱中分离得到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）,以便后期研究。     

沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行发酵风味分析。通过平板分离得到4株产香较好的芽孢杆菌,并进行16S rDNA序列分析和构建系统发育树,4株菌分别为阿式芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中地衣芽孢杆菌产蛋白酶和淀粉酶能力均为最强且最适生长温度为50 ℃。以玉米粉为底物进行单菌液态发酵,采用固相萃取和气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)分析发酵液中的风味物质,一共检测到24种风味物质,其优势产物主要为3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和一些酸类等风味物质。由此而见,阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这4类菌对沉香型白酒风味的形成均具有重要作用。     

不同地区小曲中可培养细菌的筛选及鉴定

以湖北、安徽和四川地区小曲为研究对象,利用传统培养方法和分子生物学方法研究不同地区小曲中可培养细菌的种类。结果表明,湖北小曲pH值为5.35,含水量为9.93%,密度为0.87 g/mL,共分离出8株可培养细菌,其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）6株,泛菌属（Pantoea spp.）及丰年芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）各1株;安徽小曲pH值为5.60,含水量为12.33%,密度为0.84 g/mL,共分离出5株可培养细菌,其中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）3株,埃希氏菌属（Escherichia spp.）及枯草芽孢杆菌（B. subtilis）各1株;四川小曲pH值为5.59,含水量为9.41%,密度为0.92 g/mL,共分离出7株可培养细菌,其中枯草芽孢杆菌（B. subtilis）2株,B. toyonensis、普城沙雷氏杆菌（Serratia plymuthica）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）及Burkholderia fungorum各1株。不同地区小曲中可培养细菌种类差异较大,但3种小曲均有芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。     

高温大曲曲房空气中可培养细菌的分离鉴定及产酶特性

以高温大曲曲房空气中可培养细菌为研究对象,对其进行分离鉴定及产酶特性研究;将得到的优势功能细菌进行高粱汁液态发酵,利用气相色谱—质谱联用法分析其代谢产物。结果表明：从高温大曲曲房空气中共分离出8种菌株,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、Pedobacter suwonensis、血红鞘氨醇单孢菌（Sphingomonas sanguinis）、Massilia sp.、Delftia sp.和 Sphingobacterium sp.;经产酶试验筛选得到3株优势功能菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,均具有纤维素分解能力、淀粉和蛋白水解能力;3株菌的生长曲线表明液体培养4 h达到对数生长期,在高粱汁液态发酵48 h后,优势代谢产物为3-羟基-2-丁酮,且四甲基吡嗪含量也较高,并代谢产生少量高级醇、酚类、酯类等芳香物质。     

高活性谷氨酰胺酶基因glsA_2在枯草芽孢杆菌BJ3-2染色体上的定点整合

以枯草芽孢杆菌BJ3-2的glsA1基因为同源序列,通过构建单交换整合载体,将高活性谷氨酰胺酶基因glsA2定点整合入BJ3-2菌株染色体中,获得能够稳定遗传的重组菌株BJ3-2A2。经检测重组菌株谷氨酰胺酶活力为BJ3-2菌株的3.36倍。利用重组菌株BJ3-2A2发酵豆豉,全氨基酸检测显示,重组菌株发酵的豆豉谷氨酸含量比出发菌株高12.8%。说明枯草芽孢杆菌BJ3-2可以转化且为RecE+菌株,glsA2基因在BJ3-2菌株染色体上可实现较高活性表达,并提高发酵豆豉的鲜味。     

枯草芽孢杆菌基因的安全改良研究

为了构建能稳定表达外源基因且无抗性标记基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,分两段扩增定位于B.subtilis BJ3-2染色体上的谷氨酰胺酶基因(glsA)上下游基因片段作为同源臂。将同源臂及卡那霉素基因(Kan)克隆入温敏型载体pKSV7,构建了双交换载体pKUKD。并利用pKUKD质粒将kan基因定点整合入BJ3-2染色体上,通过Kan抗性筛选获得glsA敲除菌株BJ-kan。经检测BJ3-2菌株谷氨酰胺酶活力比重组菌株高3.2倍。结果显示:BJ3-2染色体上的基因可通过同源重组方式进行敲除与置换,为今后BJ3-2菌株以及野生型B.subtilis基因敲除与置换提供了更加便捷的方法。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。     

Development of a multiplex real-time PCR to quantify aflatoxin, ochratoxin A and patulin producing molds in foods

The antimicrobial activity of 8 Bacillus spp. and 2 Lysinibacillus spp. representing the predominant aerobic sporeformers during traditional maari fermentations, a traditional fermented baobab seeds product from Burkina Faso, was investigated. The antimicrobial activity was assessed against a total of 31 indicator organisms representing various Gram-negative and positive pathogens. The screening showed that 3 Bacillus subtilis strains (B3, B122 and B222) in particular had antimicrobial activity against some Gram-positive organisms and were selected for further studies. It was found that the antimicrobial substances produced were heat stable, in-sensitive to catalase, sensitive to protease and trypsin but resistant to the proteolytic action of papain and proteinase K and equally active at pH values ranging from 3 to 11. Bacteriocin secretion started in late exponential growth phase and maximum activity was detected during the stationary growth phase. The production of bacteriocin by B. subtilis B3, B122 and B222 was dependent on the aeration conditions. Maximum production of bacteriocin was observed under reduced aeration. Specific primers were used to screen isolates B3, B122 and B222 for genes involved in the synthesis of the bacteriocins subtilosin A, subtilin, sublancin and ericin. Amplicons of the expected sizes were detected for iywB, sboA, sboX, albA and spaS involved in the biosynthesis of subtilosin and subtilin, respectively. The translated nucleotide sequences had 100% identity to the YiwB, SboX and SboA amino acid sequences of the subtilosin A producing B. subtilis subsp. subtilis strain 168. Interestingly there was a 3 amino acid deletion at the N-terminal part of AlbA in B3, B122 and B222 that probably alters the activity of this enzyme. Analysis of the spaS gene sequences of B3, B122 and B222, encoding a subtilin precursor peptide, showed that the translated nucleotide sequence had 98% identity with the corresponding SpaS amino acid sequence of subtilin producing B. subtilis subsp. spizizenii strain ATCC6633.     

高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 在枯草芽孢杆菌BJ3-2染色体上的定点整合

以枯草芽孢杆菌BJ3-2 的glsA1 基因为同源序列,通过构建单交换整合载体,将高活性谷氨酰胺酶基因glsA2 定点整合入BJ3-2 菌株染色体中,获得能够稳定遗传的重组菌株BJ3-2A2。经检测重组菌株谷氨酰胺酶活力为BJ3-2 菌株的3.36 倍。利用重组菌株BJ3-2A2 发酵豆豉,全氨基酸检测显示,重组菌株发酵的豆豉谷氨酸含量比出发菌株高12.8%。说明枯草芽孢杆菌BJ3-2 可以转化且为RecE+ 菌株,glsA2 基因在BJ3-2 菌株染色体上可实现较高活性表达,并提高发酵豆豉的鲜味。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

Development of an integrative transformation system for the opportunistic pathogenic yeast Candida lusitaniae using URA3 as a selection marker

The nucleotide sequence of the URA3 gene encoding orotidine-5'-phosphate decarboxylase (OMP DCase) of the human opportunistic pathogen yeast Candida lusitaniae was determined by degenerate PCR and chromosome walking. Deduced amino acid sequence showed strong homologies (59-85% identity) with OMP DCases of different Saccharomycetales and allowed identification of the known conserved domains. Very close upstream from the URA3 gene, the 3'-end of a gene encoding a Gea2-like protein was identified. A non-revertible C. lusitaniae ura3 mutant was selected on the basis of 5-fluoroorotic acid resistance. The mutation was a single point mutation resulting in the amino acid substitution D95V in a highly conserved domain, and in a concomitant EcoRV restriction site polymorphism. The mutant strain was successfully transformed to prototrophy following electroporation with the URA3 gene cloned in an integrative vector, with frequencies of 100-200 transformants per micro g of DNA. Southern blot analysis revealed that almost all transformants were derived from homologous recombination events at the resident locus. The GeneBank Accession No. for C. lusitaniae URA3 gene is AF450297.